AnalChem丨采用磷酸基团甲基

文章题目为TargetedProfilingofShort-,Medium-,andLong-ChainFattyAcyl-CoenzymeAsinBiologicalSamplesbyPhosphateMethylationCoupledtoLiquidChromatography–TandemMassSpectrometry，是由来自UniversityofTübingen的MichaelL?mmerhofer教授课题组近期发表在AnalyticalChemistry上的一篇文章。

研究背景

脂肪酰基辅酶A是一类由酰基辅酶A合成酶催化游离CoA-SH和脂肪酸以硫酯键结合而成的一类脂肪酰基脂质。脂肪酸被转化成脂肪酰基辅酶A后将会进入具有生物活性的酶网络，并参与多种代谢途径，在众多生物过程中发挥重要作用，例如脂质的生物合成、脂肪酸氧化、外源化合物代谢等。因此非常需要建立一种方法对生物样本中的该类化合物进行广泛检测，特别是针对一些来自有代谢综合征或者心血管疾病病人的样本。

检测方法概述

由于此类化合物中含有腺苷基团，因此早期通常使用液相色谱-紫外检测器进行检测，这种方法的分离度和灵敏度均较差。近期，鉴于LC-MS的高分离度，高灵敏度和选择性，LC-MS已经被作为常规手段用于辅酶A类化合物的检测。由于脂肪酰基链的组成多种多样，包含了不同的碳链长度、不同的饱和度、官能团，使得脂肪酰基辅酶A的物理化学性质差异很大。这种复杂性已经成为广泛检测方法开发的一个瓶颈，短链脂肪酰基辅酶A具有较高的极性，所以在反相色谱分离时通常需要酸性流动相以达到较好的分离效果；而长链的脂肪酰基辅酶A在此流动相下则表现出严重的峰拖尾现象，通常使用碱性流动相来获得较好的峰形。此外，离子对试剂也可以用来改善分离，但是单一的方法并不能保证短链-和长链-脂肪酰基辅酶A均获得较好的分离效果。为了达到化合物的全面分析，研究者们还建立的2D-LC-HRMS平台，达到同时检测的目的（文献分享丨使用2DLC-HRMS更广泛的分析酰基辅酶A类化合物）。但是此类方法实施起来相对复杂，并且通量较低，不利于大量样本分析。

因此，作者在本研究中将建立一种基于磷酸基团甲基化的简单方法，用于酰基辅酶A类物质的全面检测。经过衍生化后，不同碳链长度的酰基辅酶A类物质可以在反相色谱中被很好分离，然后结合是sSRM模式进行质谱检测，结果显示检测的覆盖率和灵敏度都得到了显著的提高，表明该方法可以通过单次分析达到对酰基辅酶A类物质全面检测的目的。

衍生化反应

选择Trimethylsilyldiazomethane(TMS-DM)作为衍生化试剂的主要原因：反应速度快，反应条件温和，且副产物和过量的反应试剂容易被去除。

反应机理如上图B所示，甲醇是质子提供者，用于原位形成重氮甲烷（CH2N2）和CH3OTMS。过量的TMS-DM用乙酸去除。反应过程中产生的所有副产物都是挥发性的，可以通过随后的蒸发步骤轻松除去。须注意的是，在衍生化和猝灭过程中会产生大量氮气，因此，衍生化反应须在通风橱中或者排风罩下进行。

作者对反应条件进行优化，并使用LC-MS对衍生化产物进行分析，对建立的方法进行方法学考察，最后将此方法应用于HeLa细胞和冠状动脉疾病患者的血小板样本检测。

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