基于莽草酸邻琥珀酰苯甲酸途径和聚酮途径合

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摘要：蒽醌及其衍生物是植物体内十分重要的次级代谢产物，具有光保护、提高植物抗病性等多种功能，同时在医药、化工等领域也具有十分重要的应用。如何高效、快速地获得蒽醌类物质、提高植物体内蒽醌类物质的合成效率，已经成为现代合成生物学的研究热点。然而蒽醌类物质合成途径较为复杂，目前普遍认为在植物体内蒽醌类物质是通过莽草酸/邻琥珀酰苯甲酸途径和聚酮途径形成。综述近年来在植物体内莽草酸/邻琥珀酰苯甲酸途径和聚酮途径合成蒽醌母核结构的研究进展，为研究植物体内蒽醌类代谢物的合成与调控提供一定的理论基础。

植物次生代谢产物是指不直接参与到植物生长、发育和繁殖过程中的有机化合物。但是次生代谢产物在植物体内分布广泛，并在植物的整个生命周期中起着十分重要的作用[1]。研究表明很多次生代谢产物在植物生长期内扮演着重要的角色，如充当着植物与周围环境相互作用的介质[2-4]、充当植物防御系统的重要组成部分[5-6]。近年来，随着研究的不断深入，植物次生代谢产物在医药领域和膳食营养方面得到了广泛应用，所以对植物次生代谢产物的研究已经成为热点。

蒽醌及其衍生物是植物体内十分重要的次生代谢产物，在植物中具有多种功能，如光保护[7]、提高植物抗病性[8]等功能。研究发现蒽醌类物质的合成代谢在细菌、真菌、地衣和高等植物中均存在[9-10]。高等植物中的蒽醌类物质主要分布在廖科（Polygonaceae）、豆科（Leguminosae）、鼠李科（Rhamnaceae）、茜草科（Rubiaceae）、黄脂木科（Xanthorrhoeaceae）植物中[11]，而且自然界植物体内的蒽醌不仅以简单的游离形态存在，还有相当一部分是以其衍生物的形式存在。很多蒽醌类代谢产物具有十分重要的药理活性，例如大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素5种蒽醌类物质是大黄主要的药效成分，具有抗菌、消炎[12]、抗癌[13]等功效。由于蒽醌类物质在医药和生物领域的重要作用，如何高效、快速地获得蒽醌类物质，提高植物蒽醌类物质的合成效率，已成为了生命科学研究的热点方向。所以研究植物和微生物体内的蒽醌代谢机制，对蒽醌类物质的高效生产具有十分重要的意义。

研究发现蒽醌类物质的合成十分复杂，合成前体涉及多个代谢途径的产物。目前对蒽醌类成分的生物合成途径尚未完全阐明，但是普遍认为植物体中蒽醌类物质（图1）生物合成主要来源于2条代谢途径：莽草酸/邻琥珀酰苯甲酸途径（shikimate/o-succinylbenzoicacidroute）和聚酮途径（polyketidepathway）。莽草酸/邻琥珀酰苯甲酸途径主要存在于茜草科植物体内，因此将该途径下产生的蒽醌也称之为茜草型蒽醌。经过该途径生物合成的蒽醌在C环中带有1个羟基化位点。聚酮途径则主要存在于一些真菌和高等植物的科属中，如豆科、廖科、鼠李科植物中。该途径可以为生物提供包括蒽醌和奈醌在内的醌类物质，以及包括黄酮类在内的各种苯丙素类物质。通过聚酮途径生成的蒽醌，其A环与C环往往会表现出一定的羟基化特性，例如在鼠李科和廖科植物中发现的大黄素与大黄酚就具有这种特性[14]。目前聚酮途径所涉及的酶系统在微生物体内已经得到了广泛的验证，但在高等植物体内研究较少[15]。本文对近年来蒽醌类物质的代谢途径研究进行了整理，将蒽醌类化合物生物合成所涉及的途径：莽草酸途径、三羧酸（TCA）循环、甲羟戊酸（mevalonate，MVA）、甲基赤藓醇磷酸（methylerythritolphosphate，MEP）途径、聚酮途径进行了整合梳理，为蒽醌类物质的生物合成代谢研究提供一定的理论基础。

1莽草酸/邻琥珀酰苯甲酸途径

莽草酸/邻琥珀酰苯甲酸途径合成蒽醌母核的前体来自于多种代谢途径。该合成途径主要涉及莽草酸途径、TCA循环、MVA途径和MEP途径。

通过该途径合成蒽醌母核的主要步骤：以莽草酸途径形成的异分支酸（isochorismicacid，IC）、来自于TCA循环的α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，AKG）和硫胺二磷酸（thiaminediphosphate，TPP）为底物，在邻琥珀酰苯甲酸（o-succinylbenzoicacid，OSB）合成酶作用下与TPP生成OSB，释放出CO2和磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）[16-17]；然后OSB辅酶A连接酶（OSB-CoAligase）将OSB的琥珀酰侧链激活，形成OSB-CoA（CoAesterofOBS）；OSB-CoA随后在DHNA-CoA合酶与DHNA-CoA硫酯酶（DHNA-CoAthioesterase）作用下环化生成1,4-二羟基-2-苯甲酸（1,4-dihydroxy-2-naphthoicacid，DHNA），作为蒽醌母核的A、B环[18-19]；DHNA与二甲基烯丙基焦磷酸（3,3-dimethylallyldiphosphate，DMAPP）结合环化，作为蒽醌母核的C环[20]，最终形成蒽醌的母核结构（图2）。

莽草酸/邻琥珀酰苯甲酸途径形成蒽醌母核的过程中IC、AKG、DMAPP为反应的进行提供物质基础，所以这几种物质的供应对代谢途径的持续进行具有十分重要的作用[21-23]。

1.1莽草酸途径合成IC

莽草酸途径在细菌、真菌、植物体内均有分布，为芳香类物质的合成提供了前体物质，目前在动物体内尚未发现[24-25]。研究发现微生物可以通过莽草酸途径产生芳香族氨基酸作为蛋白质生物合成的物质基础，如L-苯丙氨酸（L-Phe）、L-酪氨酸（L-Tyr）和L-色氨酸（L-Trp）等[26]；在植物体内，这些代谢产物不仅参与蛋白质的合成，还是多种次生代谢物合成的前体物质[27]，可以根据植物生长的需要进一步合成多种代谢产物，这些代谢产物在植物生长和抗逆作用中具有十分重要的作用[28-29]。其中IC就是通过该途径，经由多个连续的酶促反应生成的[30]。

莽草酸途径生成IC的主要反应步骤来自于糖酵解途径的PEP和来自磷酸戊糖途径的D-赤藓糖-4-磷酸（D-erythrose-4-phosphate，E4P）在DAHP合酶（DAHPsynthase）的催化下羟醛缩合生成3-脱氢-D-阿拉伯糖庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabino-hetulosonate-7-phosphate，DAHP）；DAHP在3-脱氢奎尼酸合成酶（3-dehydroquinatesynthase，DHQS）作用下去磷酸、环化生成3-脱氢奎尼酸（3-dehydroquinate，DHQ），此步骤为TCA循环的限速步骤。DHQ可以进一步生成奎尼酸（quinicacid），或者在3-脱氢喹啉酸脱水酶（DHQdehydratase）的作用下脱水，并生成3-脱氢莽草酸（3-dehydroshikimicacid，DHS）；生成的DHS可以作为莽草酸途径的分支点从而进一步生成原儿茶素（protocatechuicacid）和没食子酸（gallicacid）；或者DHS在莽草酸脱氢酶（shikimatedehydrogenase，SDH）作用下与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）发生还原反应，生成莽草酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）；莽草酸在莽草酸激酶（shikimatekinaseenzyme，SK）作用下消耗三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）生成莽草酸3-磷酸（shikimicacid3-phosphate，S3P）；S3P与PEP在5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate3-phosphatesynthase，EPSPS）催化下缩合，产生5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸（5-enolpyruvylshikimate3-phosphate，EPSP）；EPSP在分支酸合酶（chorismatesynthase，CS）作用下，去磷酸形成分支酸（chorismicacid，CHA）；CHA在IC合成酶（isochorismatesynthase，ICS）作用下生成IC[31-32]，为蒽醌的生物合成提供基础物质，见图3。

植物细胞在进行正常代谢时，需要在初级代谢与次级代谢之间进行合理分配。由于次级代谢反应往往是从初级代谢反应中获取前体物质，所以当植物初级代谢反应与次级代谢反应同时进行时，就需要合理调控二者之间的关系，以达到生产所需要的目的。初级代谢与次级代谢之间的分支点往往是控前体物质分配的关键位点。IC是莽草酸途径的产物，不仅是多种次级代谢途径的起始物质，也是蒽醌代谢合成中的重要底物[33-34]。ICS是催化CHA生成IC进入蒽醌形成途径的关键酶，在蒽醌合成调控中发挥重要作用。文献报道在巴戟天细胞培养液中蒽醌的产生总是伴随着ICS活性的增加而增加，即使在分支酸浓度较低，不足以维持正常生长的极端条件下，蒽醌积累速率与ICS活性之间仍然存在相关性[21]。

1.2TCA途径生成AKG

TCA循环在动植物、微生物细胞中普遍存在。TCA循环以乙酰辅酶A（acetyl-CoA）与草酰乙酸（oxaloacetateacid，OAA）缩合生成柠檬酸（citrateacid，CA）为起始，途径多个酶促反应，最后又生成OAA。在连续的酶促反应中会生成多种中间产物，蒽醌生物合成的原料物质AKG则来自于这一代谢途径。

TCA循环以OAA为起始经过多步酶促反应生成AKG，主要反应步骤如下：乙酰辅酶A与四碳的OAA发生缩合反应，生成CA。此步反应由CA合酶（citratesynthase，CS）催化，该酶具有高度的底物特异性，仅催化乙酰辅酶A与OAA缩合生成CA。此反应不可逆，ATP是CS的变构抑制剂。CA在乌头酸酶（aconitase，CAN）的催化作用下经过2步连续反应，生成异柠檬酸（isocitrateacid，ICA），催化反应的CAN主要分布于胞浆和线粒体之中，此步反应是可逆的，高浓度的CA可以促使反应向生成ICA的方向移动。ICA在ICA脱氢酶（isocitratedehydrogenase，IDH）作用下，经中间体草酰琥珀酸（oxalosuccinateacid）氧化脱羧生成AKG。此步反应不可逆，是整个TCA循环中的限速步骤。ADP是IDH的激活剂，而ATP、NADH是该酶的抑制剂，而且IDH需要在Mg2+或Mn2+离子的辅助下才可以发挥活性。生成的AKG之后会作为蒽醌母核结构的合成底物参与反应；或者在AKG脱氢酶复合体（α-ketoglutaratedehydrogenase