Pain横断面研究周围神经病理性

动物模型提示趋化因子是神经病理性疼痛病理生理学的重要介质。然而，来自人类的证据很少。本试验发现，与健康对照者相比，两组神经病理性疼痛患者脑脊液中趋化因子CXCL6、CXCL10、CCL8、CCL11、CCL23浓度及LAPTGF-β1蛋白浓度均明显增高，提示这些患者存在神经炎症。

研究背景

越来越多证据表明，具有免疫活性的胶质细胞（如小胶质细胞和星形胶质细胞）是慢性神经病理性疼痛病理生理机制的重要介质，因此中枢神经免疫和神经炎症机制被认为在神经病理性疼痛的病理生理机制中起重要作用。然而以上发现均源自慢性痛的动物实验，源于人类的证据很少，并且小鼠和猴类的胶质细胞（至少是星形胶质细胞）与人类存在显著差异，因此，几乎没有可直接通过动物实验结果解释的人类现象。

研究目的

确认神经病理性疼痛患者脑脊液的整体炎性特征，从而发现潜在中枢神经炎症的预测因素。

研究方法

首先，对比同一中心招募的神经病理性疼痛患者（队列1a）和健康对照者（队列1b）。随后，通过将另一中心召集的具有相似疼痛状态的患者（队列2）与队列1b比较。队列1a所有患者存在最低程度的神经病理性疼痛，队列2患者存在明确的神经病理性疼痛。纳入标准包括：（1）不小于18周岁，存在因创伤或手术引起的慢性（≧6个月）神经病理性疼痛；（2）过去一周的平均视觉模拟评分疼痛强度≧40mm；（3）患者具有判断力，即能够理解药物信息、给药方法、药效评估及副作用；（4）已签署知情同意书。所有患者曾经或仍是脊髓电刺激（SCS）候选人。健康对照组（队列1b）年龄及性别与患者相仿。队列2患者均接受SCS治疗，将SCS关闭2天，行腰椎穿刺。对每一受试者行腰椎穿刺，取10ml脑脊液。

利用多重接近扩展分析（PEA）同时分析92种蛋白质。比较患者与健康对照组时，数据用中位数（区间）表示，根据具体情况使用非参数U检验或费舍尔精确检验进行推论统计，用SPSS23.0分析数据。低于检测水平超过20%的蛋白质不进行进一步分析。对每种蛋白质，通过两独立样本Mann–WhitneyU检验分析其在两组之间是否存在表达水平差异。通过错误发现率（FDR）方法调整多重检验P值。

使用SIMCA13.0软件进行多元数据投射分析。多元数据投射分析可同时分析所有变量，考虑数据集的相关性结构，更倾向于数据结构和信息，可降低噪声值和假阳性率。概括说来，数据先经主成分分析（PCA）筛查，PCA在概念上可视为多变量相关分析。但是，这里PCA是用于识别数据中的离群值和偏离亚组。随后，用正交偏最小二乘法辨别分析（OPLS-DA，一种回归分析）识别对类型差异（二分Y变量）起主要作用的蛋白质（X变量）。回归分析统计学意义用方差分析交叉验证（CV-ANOVA）得到的P值表达。类型差异强度可通过统计图表示，该图显示各独立样本与模型的两个首要潜在变量之间的关系（分数图）。各蛋白质（X变量）对类型差异的相对重要性用变量对投射影响值（VIP）表示，VIP﹥1表示该变量对类型差异（Y变量）的影响高于平均水平。本试验将1.3作为报告引起类型差异的兴趣蛋白的VIP截断值。

表1.队列1a（n=11）神经病理性疼痛患者的特征

表3.队列2（n=16）神经病理性疼痛患者的特征

研究结果

1.神经病理性疼痛患者（队列1a）与健康对照组（队列1b）的比较

神经病理性疼痛患者（队列1a，n=11）与健康对照组（队列1b，n=11）的年龄（平均年龄分别为57岁[39~65]与54岁[44~57]，P=0.）和性别（女性组成分别占55%和64%，P=1.0）无明显差异。队列1a患者详细信息见表1。

控制FDR的多变量检验：92种炎症相关蛋白中，42种低于最低检测水平超过20%，分析其余50种炎症相关蛋白水平发现，当FDR为10%时，以下炎症相关蛋白明显与神经病理性疼痛相关：CXCL1，CXCL5，CXCL6，CXCL10，CCL3，CCL8，CCL11，CCL19，CCL23，LAPTGF-β1和LIF-R（表2和图1）。以上11种蛋白中9种是趋化因子。PCA分析队列1a和1b（两个主要指标，R2=0.62，Q2=0.46）未发现离群值。随后，用OPLS-DA模型计算（1个可预测组内潜变量和1个组间潜变量，R2=0.67和Q2=0.43），结果显示患者与健康对照者之间存在明显差异（CV-ANOVA统计P=0.；图2）。11个蛋白的VIP﹥1.3（即对组间差异起重要作用），这11种蛋白与上文用FDR得出的结果相同；OPLS-DA的VIP值见表2。

表2.与健康对照者（队列1b）相比，神经病理性疼痛患者（队列1a）脑脊液中表达上调的炎性相关蛋白

图1.与健康对照组（队列1b）相比，神经病理性疼痛患者（队列1a）脑脊液中差异最明显的11种炎症相关蛋白。蛋白水平（Y轴）使用标准化蛋白表达，见接近扩展分析部分描述。中位数用水平直线表示，四分位间距用箱图表示。末端分别表示1.5倍四分位间距的最低值与最高值。点表示离群值。

图2.正交偏最小二乘法辨别分析比较神经病理性疼痛（队列1a）与健康对照组（队列1b）脑脊液炎症相关蛋白的二维评分图。沿t[1]轴为神经病理性疼痛患者（n=11，标记“1”的绿色点）与健康对照者（n=11，标记“2”的蓝色点）之间的类别区分（组间变异）。to[1]轴代表组内变异。椭圆形代表识别强离群值时使用的HotellingT2检验的95%可信区间。

2.神经病理性疼痛患者（队列2）与健康对照者（队列1b）的比较

队列2患者（n=16）与健康对照组（队列1b，n=11）的年龄（平均年龄分别为56[46~68]与54岁[44~57]，P=0.）和性别（女性组成分别占69%和64%，P=1.0）无明显差异。队列2患者详细信息见表3。分析的炎症相关蛋白共50种。

PCA分析队列2和队列1b（2个主要指标，R2=0.69，Q2=0.57）；未发现离群值。用OPLS-DA模型分析队列2和队列1b（1个可预测组间潜变量和2个组间潜变量，R2=0.90和Q2=0.66；CV-ANOVA统计P﹤0.）。11种蛋白的VIP﹥1.3，在患者中高表达：LAPTGF-β1，CCL11，4E-BP1，CXCL10，CCL23，CX3CL1，CXCL6，CD5，CCL8，CCL25和CXCL11（按照VIP从大到小排列，VIP值在1.75到1.31之间）。

3.两组神经病理性疼痛患者之间的共同点

2个OPLS-DA模型分别得出的11种差异最大的蛋白之间存在55%的交叉，相同的蛋白包括LAPTGF-β1，CCL11，CXCL10，CCL23，CXCL6和CCL8。与健康对照组相比，LIF-R，CXCL1，CCL19，CXCL5和CCL3的明显差异仅见于队列1a，而4E-BP1，CX3CL1，CD5，CCL25和CXCL11的差异仅见于队列2。在仅1组存在显著差异的蛋白中，同时在另一组的VIP值在1.0到1.3之间（即在另一组中也与神经病理性疼痛相关，只是关系不显著）的5个蛋白为：CXCL1，CXCL5，CXCL11和CX3CL1。

研究结论

利用炎症相关蛋白组学，本试验首次尝试描述神经病理性疼痛患者脑脊液的整体炎症“指纹”，发现神经病理性疼痛患者存在神经炎症的证据。两个相对具有可比性的患者队列得出结果非常相似（尽管不完全一致），试验结果表明，与健康对照者相比，神经病理性疼痛患者脑脊液中的一系列趋化因子表达上调。我们认为本试验结果很可能反映了慢性疼痛状态下的中枢神经炎症。但是，这些结果仍需进一步研究证实，因果关系也仍然难以明确。因为慢性疼痛普遍存在的共存疾病也可能与神经炎症相关，明确特异性和共同介质也至关重要。

动物模型中，神经炎症对痛行为的影响具有三大特征：（1）免疫细胞浸润，（2）胶质细胞激活，和（3）炎性介质产生。神经炎症可通过趋化因子和细胞因子通路促进神经病理性疼痛的中枢敏化。本试验可以说将中枢神经炎症实现了“可视化”，而中枢神经炎症则是与慢性疼痛状态下中枢敏化、痛觉下行抑制损伤和痛觉过敏等特征相关的可能机制。

局限性

两个神经病理性疼痛队列都与同一对照组进行比较是本试验的主要局限，且长期SCS治疗很可能改变了队列2患者的脑脊液炎性特征。另外，传统治疗手段对这两个神经病理性疼痛队列患者的效果均很差，因此，本试验的结果不能推广至所有神经病理性疼痛状态。

本试验未解决脑脊液炎性指纹与神经病理性疼痛之间的因果关系问题，也未考虑与疼痛共存的疾病状态，如抑郁、焦虑和睡眠不佳。

B?ckrydE,LindAL,ThulinM,etal.Highlevelsofcerebrospinalfluidchemokinespointtothepresenceofneuroinflammationinperipheralneuropathicpain:across-sectionalstudyof2cohortsofpatients







































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