肝过氧化物酶体氧化产生的乙酰辅酶A通过

北京治疗白癜风的医院 http://wapjbk.39.net/yiyuanzaixian/bjzkbdfyy/

原文出处

AnyuanHe,XiaowenChen,MinTan,etal.Acetyl-CoADerivedfromHepaticPeroxisomalβ-OxidationInhibitsAutophagyandPromotesSteatosisviamTORC1Activation.Mol.Cell.Jul02;79（1）

研究背景

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是世界上最常见的肝病，全球患病率约为25%。NAFLD以肝脏脂肪变性为特征，通常与肥胖有关。目前没有专门治疗NAFLD的药物。脂肪肝的发展涉及脂质稳态的失调，是由参与脂质合成、摄取、储存和分解代谢的各种代谢途径的协调调节所控制的。因此，靶向脂质代谢途径可能是治疗脂肪肝的有效策略。

过氧化物酶体在脂质代谢中起着至关重要的作用，它参与了脂质代谢的各个方面，包括醚脂合成、胆汁酸合成、支链脂肪酸的α氧化和长链脂肪酸的β氧化。过氧化物酶体β氧化的第一步是由酰基辅酶A氧化酶1（Acox1）进行的，Acox1优先分解直链脂肪酸，而相关酶Acox2和Acox3则以参与胆汁酸合成的支链脂肪酸和中间体为底物。Acox1整体敲除小鼠是可行的，但生长迟缓，且这些小鼠表现出脂肪性肝炎，并在内质网应激增加的情况下发展为肝癌。影响Acox1内含子11-12的剪接供体位点的点突变可导致蛋白质c末端区域的部分缺失这样点突变的小鼠（被称为Acox1Lampe1小鼠）可表现为肝脂肪变性，进而进展为脂肪性肝炎，最终导致肝细胞癌。来自Acox1Lampe1小鼠的骨髓移植到野生型受体小鼠中，受体鼠表现为肝细胞损伤和全身炎症，提示免疫细胞中Acox1抑制（而不是肝细胞本身）对表型起作用。因此，Acox1在肝细胞中的生理意义尚不清楚。

为了研究肝脏过氧化物酶体β氧化的作用，作者构建了肝脏特异性敲除Acox1的小鼠（Acox1-LKO小鼠）。本文中作者报道了肝Acox1缺乏可诱导脂噬（一种可降解细胞内脂滴的大自噬亚型）。自噬是一个自我消化的稳态过程，它涉及溶酶体降解细胞质内容物，包括整个细胞器、蛋白质聚集体和脂滴，自噬是由mTORC1（雷帕霉素复合物1的机械靶点）调控的，它是一种关键的生长和代谢调节复合物，一种调节底物向mTORC1的募集及其亚细胞定位和激活的适配蛋白。复合物通过感知营养物质来调节自噬。在营养充足的情况下，mTORC1通过多个自噬相关蛋白的磷酸化而被激活，进而抑制自噬。激活mTORC1还导致参与溶酶体生物发生和功能基因的抑制，包括介导脂噬的溶酶体酸性脂肪酶（LAL）。报告显示过氧化物酶体β氧化衍生的乙酰辅酶A通过促进mTORC1的激活而抑制脂噬。这些发现提示抑制肝Acox1可能是治疗NAFLD的一种有效的策略。

研究结果

1.Acox1-LKO小鼠模型的建立

基因表达分析表明Acox1在肝脏中高表达（Figure1A）。然而，其在肝脏中的生理作用尚不清楚。具有整体敲除Acox1的小鼠已经产生，但它们表现出生长迟缓，不利于代谢分析。因此，作者通过将Acox1小鼠与白蛋白-Cre小鼠杂交，生成了Acox1-LKO小鼠（Figure1B）。肝脏定量实时PCR分析表明，Acox1-LKO小鼠Acox1的表达明显降低，而Acox2或Acox3表达不受影响（Figure1C），蛋白印迹分析证实了Acox1的敲除（Figure1D）。通过对照和Acox1基因敲除肝细胞的质谱分析，测定稳定同位素标记的二十二烷酸（D3-C22:0）对D3-C16:0的分解代谢，确定了Acox1缺乏导致极长链脂肪酸（VLCFA）氧化中断，（图1E）。与受损的脂肪酸氧化一致，VLCFA在Acox1LKO小鼠的肝脏和血清中积累（Figure1FandS1A）。对照组和敲除动物在2个月或12个月大时的体重无差异（FigureS1B）。然而Acox1-LKO小鼠在2个月龄时肝体重量比略有增加，在12个月龄时没有逐渐恶化（FigureS1C）。在Acox1-LKO小鼠中，肝糖原含量显著增加，这可能解释了突变小鼠肝脏重量的增加（FiguresS1DandS1E）。Acox1Lampe1小鼠在8周龄时发生肝细胞癌，癌标记物的表达显著增加，而12个月龄Acox1-LKO小鼠的肝脏外观正常（FigureS1F），缺乏癌标记物AFP、H19和Ki67的表达（FigureS1G）。炎症标志物IL-6和TNFa在Acox1-LKO小鼠的肝脏中也几乎无法检测到，类似于对照小鼠（FigureS1H）。与肝功能正常的敲除小鼠一致，血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平不变（FigureS1I）。以上结果表明肝脏特异性Acox1失活不会导致肝脏损伤或导致肝细胞癌。

2.Acox1-LKO小鼠对饥饿引起的脂肪肝有保护作用

过氧化物酶体可能在线粒体无法补偿的β氧化中起作用。鉴于肉碱棕榈酰转移酶2（CPT2）的LKO对线粒体脂肪酸氧化的抑制加剧了饥饿诱导的脂肪肝，作者试图确定饥饿对Acox1-LKO和对照小鼠肝脏的影响（Figure2），24小时禁食导致对照组小鼠脂肪肝，然而，Acox1-LKO小鼠对饥饿诱导的脂肪肝具有保护作用（Figure2A）。肝脏甘油三酯的Bodipy染色和测量证实了Acox1-LKO小鼠脂质积累的减少（Figures2BandC）。这些结果是对雌性小鼠实验得出，在雄性动物中也得到证实（FigureS2A）。为了确定对脂肪肝的保护是否是由Acox1的丢失特异性介导的，作者用表达Acox1或GFP的腺相关病毒（AAV）处理小鼠。在敲除小鼠中，AAV-Acox1增加了Acox1蛋白水平，逆转了对脂肪肝的保护，导致甘油三酯的积累增加（FigureS2BandD）。在Acox1-LKO小鼠中，肝脏脂质积累的减少可能反映脂肪组织脂解减少或甘油三酯增加。空腹对照和Acox1-LKO小鼠血清中游离脂肪酸水平相当（Figure2D），提示脂肪组织脂解不受Acox1肝脏特异性失活的影响。与这种可能性一致的是，禁食小鼠的体重或脂肪质量没有基因型特异性差异（FigureS2EandF）。用抑制脂蛋白脂肪酶活性的非离子洗涤剂poloxamer-处理禁食小鼠,甘油三酯分泌率在Acox1-LKO和对照小鼠之间无变化（（Figure2E），表明抑制过氧化物酶体β氧化不会增加肝脏甘油三酯的输出。对照组与Acox1-LKO小鼠血清胆固醇水平也相似（FigureS2G）。为了探讨Acox1-LKO小鼠抗饥饿性脂肪肝的机制，作者接下来进行了基因表达分析（Figure2F）。参与脂肪从头生成（CHREBP、SREBP、FASN、ACLY和ACC1）和甘油三酯合成途径（AGPAT和DGAT）的基因在肝脏中的表达不变（Figure2F）。线粒体底物C标记棕榈酸酯表明，过氧化物酶体β氧化的破坏不会损害而是增加线粒体β氧化（Figure2G）。由于过氧化物酶体β氧化被认为有助于丙二酰-CoA的生成，作者测量了丙二酰-CoA在Acox1-LKO和对照小鼠肝脏中的水平。虽然没有统计学意义，但在敲除小鼠中的水平略低（FigureS2H）。然而，单凭线粒体β氧化的增加不太可能解释Acox1-LKO小鼠对脂肪肝的保护，因为先前的研究表明，通过肝脏过表达丙二酰Co-A不敏感的Cpt1来提高肝脏线粒体脂肪酸氧化能力不足以防止肝脏脂肪变性。这可能是因为脂肪酸首先必须通过脂解从甘油三酯中释放出来，然后才能在线粒体中进行β氧化。在对照组和Acox1-LKO小鼠之间（Figure2F），脂解酶（ATGL和HSL）的基因表达不变。然而，由于脂解的控制主要是通过调节脂肪酶对脂滴的吸收，而不是在基因表达水平上，作者还评估了ATGL的脂滴定位是否被改变。禁食小鼠肝脏的免疫荧光分析表明，Acox1失活不影响ATGL向脂滴的募集（FigureS2IandJ）。脂噬是储存在脂滴中的甘油三酯被水解，生成游离脂肪酸和甘油的一种过程，介导脂滴自噬降解的LAL在Acox1-LKO小鼠的肝脏表达显著增加（Figure2F）

3.肝脏Acox1敲除促进自噬的激活

作者接下来要确定Acox1基因敲除是否会导致肝脏自噬的激活。在敲除acox1的肝脏中，自噬标记物p62和LC3的蛋白水平显著降低，但相应的mRNA水平没有差异（Figure3AandB），表明诱导自噬。与p62和LC3蛋白水平降低反映自噬通量增加的观点一致，用溶酶体蛋白酶抑制剂Leupeptin处理小鼠后，对照组和Acox1-LKO小鼠中自噬标记物积累（Figure3C）。为了进一步评估自噬激活，作者将带荧光的LC3质粒经尾静脉（HTV）注入对照组和Acox1-LKO小鼠中，然后，用或不用氯喹处理。自噬体表现出mCherry和GFP的双重荧光，而自噬溶酶体主要表现为红色荧光，因为GFP的荧光在酸性的溶酶体内环境中被淬灭了。因此GEP荧光相对于mCherry荧光的下降表明自噬通量增加。此外，Acox1-1LKO小鼠肝脏GFP荧光降低（Figures3Dand3E），这与这些小鼠自噬的激活一致，正如预期的那样，氯喹治疗阻断了Acox1-LKO和对照小鼠的自噬通量。

鉴于Acox1-LKO小鼠对脂肪肝的保护作用，作者接下来确定突变肝脏中的脂滴是否与溶酶体有关，这将提示脂噬的激活，免疫荧光分析表明，脂质滴染色使用抗危脂素2（PLIN2）抗体与溶酶体共定位，使用抗LAMP2（Figure3Fand3G）抗体染色。总之，这些结果表明，过氧化物酶体β氧化的失活通过脂噬促进脂滴水解而保护脂肪肝，然后在线粒体中进行脂肪酸氧化。

为了确定Acox1-LKO小鼠的表型是否是通过激活自噬来介导的，作者在Acox1-LKO或野生型小鼠上特异性敲除肝内Atg5。正如预期的那样，Atg5基因敲除导致p62和LC3的积累，并在Acox1-LKO小鼠中消除了这些自噬标记的减少（FigureS3A）,证实了这种减少是通过诱导自噬介导的。此外，ATG5单基因敲除也显著降低了Acox1水平（FigureS3A）,这可能反映了一种反馈机制。单独敲除Atg5或在Acox1失活的背景下导致大量的肝肿大（FigureS3BandS3C）,这与之前的报导一致，表明自噬的基因失活导致严重的肝损伤，其特征是几种病理变化，包括纤维化、炎症、血清ALT和AST水平升高、蛋白质大量积累和肿瘤发生。相反，在Atg5-LKO小鼠中，肝甘油三酯含量下降（FigureS3D）,这与最近的研究结果相一致，除了调节脂滴的降解外，脂滴的生物发生可能还需要自噬。总的来说，抑制肝脏中的大自噬会导致严重的异常和复杂的表型，而通过药理学或遗传学手段激活脂肪吞噬可以保护肝脏脂肪变性。

4.过氧化物酶体β-氧化是调节mTORC1-自噬轴的乙酰CoA的主要来源

接下来，作者试图了解过氧化物酶体β氧化在肝脏中的破坏如何促进脂质的自噬降解。在饥饿条件下自噬是通过激活AMPK诱导的，AMPK反过来磷酸化并激活ULK1。因此，作者想确定AMPK在肝脏中的激活是否受到Acox1失活的影响。蛋白质印迹分析表明，AMPK激活所必需的Thr位点磷酸化在Acox1-LKO小鼠中没有发生变化（FigureS4A）。因此，作者探索了其他潜在的机制。过氧化物酶体β氧化的产物之一是可诱导自噬的H2O2（Figure4A）。为了了解Acox1基因敲除对肝脏ROS的影响，作者生成了一种过氧化物酶体靶向形式的RoGFP（RoGFP-SKL），一种氧化还原敏感的GFP，在nm处表现出第二个激发峰（反映氧化状态），此外还有GFP的规则激发波长（~nm）。利用HTV注入，作者在肝脏中异位表达了RoGFP-SKL，用共聚焦显微镜检测Acox1-LKO和对照小鼠的荧光（FigureS4B）。在两种不同波长激发后荧光比的定量表明，Acox1敲除肝脏中过氧化物酶体ROS水平显著降低（FigureS4C）。线粒体也是ROS的主要贡献者。然而，在Acox1敲除肝脏中（FigureS4DandS4E），线粒体靶向RoGFP（MitoRoGFP）也降低了ROS水平，这可能是过氧化物酶体ROS产生减少的次要影响，因为H2O2可以在细胞器膜上自由扩散。由于Acox1的失活降低了H2O2的产生，因此Acox1-LKO小鼠中自噬的诱导可能不是由ROS水平升高引起的。过氧化物酶体β氧化的另一产物是乙酰辅酶A（Figure4A）。每个β氧化循环都会产生一个短短两个碳原子的酰基链，并通过巯基裂解乙酰基CoA末端基团。胞质乙酰辅酶A被认为是自噬的关键代谢调节剂，其耗竭足以诱导一般自噬。最近的研究表明，来自亮氨酸分解代谢的乙酰辅酶A促进了Raptor的乙酰化，导致溶酶体定位和mTORC1的活化。然而，尚未确定由该乙酰辅酶A介导的乙酰化是否调节自噬。而过氧化物酶体来源的乙酰辅酶A是否通过激活mTORC1调节肝脏中脂质的自噬。首先，作者确定了抑制过氧化物酶β氧化对肝脏中乙酰辅酶A水平的影响。禁食的Acox1-LKO小鼠中的总胞浆乙酰辅酶A库少于对照组小鼠的50％（Figure4B）。此外，人们认为胞质乙酰辅酶A主要是通过ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）的作用而从柠檬酸衍生而来的。酰基辅酶A合成酶短家族成员2（ACSS2），可将乙酸转化为乙酰辅酶A，也有助于胞质池。然而，空腹时ACLY和ACSS2的肝基因表达明显下降，而Acox1基因的表达却增加。而且，基于定量实时PCR的循环阈值（Ct），肝脏中Acox1的表达可能比ACLY和ACSS2高（Figure4C）。Western印迹分析证实，空腹肝脏中Acox1表达增加，而ACLY和ACSS2减少（Figure4D）。因此，Acox1介导的脂肪酸氧化是肝脏中胞溶型乙酰辅酶A的主要来源，尤其是在禁食状态下。接下来，作者想确定Acox1的失活是否会影响Raptor的乙酰化。为此，作者使用HTV注射在Acox1-LKO和对照小鼠的肝脏中表达FLAG-Raptor质粒。使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后使用针对乙酰化赖氨酸（AcK）的抗体进行蛋白质印迹分析，表明在突变小鼠中Raptor乙酰化显着降低（Figure4E）。为了确定Acox1的失活是否影响内源性Raptor和其他蛋白质的乙酰化，作者使用AcK抗体对禁食小鼠的肝裂解液进行了免疫沉淀。Western印迹分析表明，内源性Raptor乙酰化显着降低，而组蛋白H3的乙酰化不受Acox1敲除的影响（Figure4Fand4G），表明过氧化物酶体生成的乙酰辅酶A在乙酰化中可能具有选择性作用。在这方面，先前的研究表明溶酶体与过氧化物酶体形成膜接触。使用抗过氧化物酶体和溶酶体标记物的抗体进行的免疫荧光分析表明，禁食可促进过氧化物酶体与肝中的溶酶体的共定位（Figure4Hand4I），从而增加了与溶酶体相关的Raptor可能受到局部产生的过氧化物酶体介导的乙酰化作用的可能性。乙酰辅酶A与受损的内源性Raptor乙酰化一致，mTOR的溶酶体定位在Acox1基因敲除肝脏中被阻滞（Figure4Jand4K）。鉴于其激活需要将mTOR分布到溶酶体中，Acox1失活导致mTOR受到抑制，这通过下调mTOR的Ser磷酸化和降低其下游靶点的磷酸化来评估。重要的是，mTORC1抑制导致ULK1的Ser磷酸化降低，从而调节自噬作用。并且，在Acox1-LKO小鼠中PLIN2水平也降低了（Figure4LandS4F）。与这反映出脂质滴的自噬降解增加的可能性一致，用亮肽素对禁食的对照组和Acox1-LKO小鼠进行腹膜内处理会导致PLIN2积聚（Figure4M）。由于mTORC1受能量状态的调节，我们还确定了在进食和禁食条件下其激活是否受到Acox1敲除的影响（Figure4N）。禁食可显着抑制控制mTORC1途径合成代谢臂的S6K磷酸化，而在Acox1基因敲除的肝脏中，残留的磷酸化进一步降低。相比之下，调节分解代谢臂的ULK1磷酸化仅被禁食部分抑制，而Acox1基因敲除则发生更完全的抑制作用。这些数据表明，即使在禁食条件下，Acox1仍可维持mTORC1活化和抑制性ULK1磷酸化的基础水平。

5.在Acox1-LKO小鼠中增加乙酰辅酶A水平可恢复mTORC1激活，抑制自噬，并提高甘油三酯水平

为了确定Acox1-LKO小鼠mTORC1激活受损和肝甘油三酯积累减少是否是由于细胞浆乙酰辅酶A水平降低所致（Figure5），作者用二氯乙酸（DCA）处理Acox1-LKO小鼠（Figure5A），该酸通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）增加细胞乙酰辅酶A水平，从而促进丙酮酸脱氢酶（PDH）的激活。DCA处理恢复了Acox1-LKO小鼠的肝脏乙酰CoA水平（Figure5B）。值得注意的是，这种干预将Acox1-LKO小鼠肝脏中的内源性Raptor乙酰化恢复到与对照小鼠相似的水平（Figure5Cand5D）。因此，在Acox1-LKO小鼠中，DCA处理可使mTOR的溶酶体定位增加到与对照小鼠相当的水平（Figure5Eand5F）。这导致mTOR激活和ULK1磷酸化增加，从而抑制自噬，这反映在p62和肝脏（Figure5G）中的LC3。与抑制脂噬相反，DCA处理降低了Acox1-LKO小鼠肝脏中PLIN2与LAMP2的共定位（Figure5Hand5I），并部分恢复了突变小鼠的肝甘油三酯水平（Figure5J），而不影响参与甘油三酯合成途径的基因的表达。总之，这些结果表明，来自过氧化物酶体β氧化的乙酰辅酶A通过介导mTORC1的激活而抑制脂质的自噬降解。

6.Acox1-LKO小鼠受高脂饮食诱导脂肪肝的保护

肥胖与NAFLD的风险增加有关。此外，与瘦人相比，肥胖者肝脏中Acox1基因的表达趋势更高（Figure6A）。在小鼠中，高脂喂养导致肝脏Acox1基因表达急剧增加（Figure6B）。由于Acox1-LKO小鼠受到饥饿诱导的脂肪肝的保护，作者想确定这些小鼠是否也受到高脂饮食（HFD）诱导的脂肪肝的保护。结果表明，与对照小鼠的肝脏相比，Acox1-LKO肝脏的颜色明显没有那么苍白，提示对饮食引起的脂肪变性有保护作用（Figure6C）。肝脏切片的组织学分析表明，Acox1-LKO小鼠的脂滴明显较小（Figure6D）。与这些结果一致，Acox1-LKO小鼠与对照小鼠相比（Figure6E），肝脏甘油三酯含量降低。作者还评估了Acox1失活对高脂喂养背景下mTORC1激活的影响。与对照小鼠相比，Acox1-LKO表现出受损的肝脏mTORC1激活，这是由mTOR、S6K和ULK1磷酸化降低所评估的（Figure6F）。这些数据表明，通过抑制mTORC1而激活自噬/脂噬Acox1-LKO小鼠免受HFD诱导的脂肪肝。

研究结论

1.禁食或高脂饮食可增加Acox1的肝脏基因表达；

2通过诱导脂肪吞噬来保护dAcox1-LKO小鼠免受脂肪肝的影响；

3.Acox1介导的b氧化产生的乙酰CoA可激活mTORC1并抑制脂噬；

4.在药理学上增加乙酰辅酶A可挽救Acox1-LKO小鼠的表型；

校对：张杨贺