生物化学酶第二节

二、柠檬酸循环

1、丙酮酸脱氢酶复合体

　又称丙酮酸脱氢酶系，是一种催化丙酮酸脱羧反应的多酶复合体，由三种酶（丙酮酸脱氢酶E1、二氢硫辛酸转乙酰基酶E2、二氢硫辛酸脱氢酶E3）和六种辅助因子（焦磷酸硫胺素、硫辛酸、FAD、NAD、CoA和Mg离子）组成，在它们的协同作用下，使丙酮酸转变为乙酰CoA和CO2。催化哺乳动物中使丙酮酸转化为乙酰辅酶A的唯一途径的酶，乙酰CoA抑制E2，NADH抑制E3，为竞争性抑制。

　　丙酮酸脱氢酶复合体催化的反应式是：

　　CH3—CO—COO-+CoA~SH+NAD+→CH3—CO~CoA+CO2+NADH；

　　△G=-33kl/mol

　　大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体相对分子质量约4，，，外形呈球状，其直径约为30nm。复合物核心由24个二氢硫辛酸转乙酰基酶构成，24个丙酮酸脱氢酶和12个二氢硫辛酸脱氢酶环绕二氢硫辛酸转乙酰基酶排列。真核的丙酮酸脱氢酶复合体更为复杂。在真核中，该复合物由60个丙酮酸脱氢酶和12个二氢硫辛酸脱氢酶环绕60个二氢硫辛酸转乙酰基酶排列而构成12面体。除含有这些主要成分外，真核生物的酶复合物还含有12个拷贝的蛋白质X（一种无催化活性的、与二氢硫辛酸转乙酰基酶相似的蛋白质）和1至3个拷贝的丙酮酸脱氢酶激酶和丙酮酸脱氢酶磷酸酶。这后两种酶通过使该酶复合物磷酸化和去磷酸化调节其活性。Ga2+使丙酮酸脱氢酶活化

2、柠檬酸合酶

编号：EC2.3.3.1。催化乙酰辅酶A的甲基去质子而形成负碳离子，亲核攻击草酰乙酸的羰基碳缩合生成柠檬酰辅酶A，再经高能硫酯键水解，生成柠檬酸的酶。

催化来自糖酵解或其它异化反应的乙酰CoA与草酰乙酸缩合合成柠檬酸反应的酶。因为由乙酰CoA游离出CoA是放能反应（ΔG0′=-7.7千卡），以致平衡趋于生成柠檬酸的方向。

　　此酶控制三羧酸循环的入口，受到多种调控，属调控酶。它是变构酶，受NADH、ATP和α-酮戊二酸别构抑制，丙酮酰辅酶A、琥珀酰辅酶A与乙酰辅酶A竞争抑制，AMP可对抗ATP的抑制，起激活作用。

　　在肝脏和其它组织中成为三羧酸循环的限速步骤，是限速酶，存在于线粒体基质（mit-ochondrialmatrix）中。氟乙酰辅酶A：底物，形成氟柠檬酸，不能往下反应，称致死性合成

3、顺乌头酸酶

编号：EC4.2.1.3。一种含Fe-S簇的酶，称铁-硫蛋白或非血红素铁蛋白，在三羧酸循环中，催化从柠檬酸经顺乌头酸生成异柠檬酸的可逆性异构化。

在pH7.0，25°C的平衡态时，柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：4：6

4、异柠檬酸脱氢酶

有两种类型的酶：要求以NAD为辅酶的酶（EC1．1．1．41）和要NADP的酶（EC1．1．1．42），两者催化同一反应。在胞液中以NADP+为辅酶，在线粒体内膜中以NAD+为辅酶。

　　异柠檬酸+NAD（P）+==α-酮戊二酸+CO2+NAP（P）H+H4

　在三羧酸循环中正常起作用的是要求NAD为辅酶的酶，此酶是为ADP激活的变构酶。TCA中第一次氧化作用、脱羧过程、异柠檬酸脱氢酶为第二个调节酶、三羧酸到二羧酸的转变

以NAD+为辅酶的异柠檬酸脱氢酶需要Mg2+或Mn2+激活。只存在于线粒体中，另一种既可存在于线粒体，也可存在于细胞溶胶中。能促进C—C键的断裂，成为β-裂解，它所断裂的C—C键正是柠檬酸循环第一步反应中，进入循环的乙酰基中连接乙酰基的两个碳原子之间的键。

它是变构调节酶，受ADP变构激活。ADP可以增强酶与底物的亲和力，该酶与异柠檬酸、Mg2+、NAD+、ADP的结合有相互协同作用。NADH、ATP对该酶起变构抑制作用。

细菌中的异柠檬酸脱氢酶受磷酸化的抑制

5、α-酮戊二酸脱氢酶复合体

完成α-酮戊二酸氧化脱羧成为琥珀酰COA的酶，是TCA中第二次氧化作用、脱羧过程，α-酮戊二酸脱氢酶复合体与丙酮酸脱氢酶复合体相似，由三种酶（α-酮戊二酸脱氢酶E1、二氧硫辛酰转琥珀酰酶E2、二氢硫辛酰脱氢酶E3）和六种辅助因子（TPP、硫辛酸、COA、FAD、NAD+、Mg2+）组成，在它们的协同作用下完成α-酮戊二酸氧化脱羧成为琥珀酰COA。α-酮戊二酸脱氢酶受其产物琥珀酰COA和NADH的抑制，也同样受高能荷的抑制，因此当细胞中的ATP充裕时，柠檬酸循环进行的速度就减慢。α-酮戊二酸脱氢酶不受磷酸化、去磷酸化共价修饰的调节作用。

6、琥珀酰COA合成酶

能催化琥珀酰COA转化成琥珀酸，并产生GTP，此过程是TCA中唯一底物水平磷酸化直接产生高能磷酸化合物的步骤，底物磷酸化GTP+ADP生成GDP+ATP

琥珀酰CoA合成酶(succinatedehydrogenase)(或称琥珀酸硫激酶)催化琥珀酰CoA转化为琥珀酸,琥珀酰CoA的硫酯键水解会释放出很多的自由能,这些能量可用于驱动GTP(哺乳动物中)或ATP(植物和一些细菌中)的合成。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸

　　这是柠檬酸循环中的第三步氧化还原反应，带有辅基FAD的琥珀酸脱氢酶（succinatedehydrogenase）催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸（反丁烯二酸），同时使FAD还原为FADH2。生成的FADH2再被辅酶Q氧化生成FAD，而辅酶Q还原为还原型辅酶Q（QH2）。QH2被释放到线粒体的基质中。

7、琥珀酸脱氢酶

编号：EC1.3.99.1。在三羧酸循环中催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸的酶

琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。该酶以FAD作为其脱下电子的受体，而不是NAD+。琥珀酸脱氢酶与FAD的关系是以共价键相互连接，因此它是酶和辅基的关系。很特别，因为一般FAD与酶以非共价键形式结合。尽管琥珀酸脱氢酶的作用是专一的，但丙二酸（与底物结构上很相似）可以与该酶结合，但酶不能催化其脱氢，因此丙二酸是琥珀酸的强抑制剂。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸的脱氢具有严格的立体专一性。

琥珀酸脱氢酶与柠檬酸循环中的其它酶不同，是唯一嵌入到线粒体内膜的酶，是线粒体内膜的一个重要部分，二其它酶大多存在于线粒体的基质。

是含铁-硫中心的黄素蛋白，琥珀酸脱氢酶是线粒体的一种标志酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。琥珀酸脱氢酶（Succinatedehydrogenase，简称SDH），黄素酶类，是线粒体内膜的结合酶，属膜结合酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，为线粒体的一种标志酶。作为参与三羧酸循环的关键酶，琥珀酸脱氢酶是反映线粒体功能的标志酶（markerenzyme）之一，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标，对于评价精子线粒体功能、研究致奶牛酮缺乏症病理过程等具有重要意义。

8、延胡索酸酶

催化延胡索酸水化生成L-苹果酸

延胡索酸酶（fumarase）（延胡索酸水化酶（fumaratehydratase））通过将H2Otrans立体特异添加到延胡索酸双键上，催化延胡索酸水化生成L-苹果酸，反应是可逆的。延胡索酸也象柠檬酸一样是一个前手性分子，当延胡羧酸被定位在酶的活性部位时，底物的双键只受到来自一个方向的攻击。编号：EC4.2.1.2。柠檬酸循环中的一种酶。催化延胡索酸水化成苹果酸的可逆反应，具有立体特异性，正反应中只催化反式双键的水化，逆反应只催化形成苹果酸的L-异构体。

延胡索酸酶（反丁烯二酸酶）fumarase正式名称为延胡索酸水化酶（fumaratehydra－tase），是催化延胡索酸+H2O→L-苹果酸可逆进行相互转变反应的酶，EC4．2．1．2．最适pH=6.5-8.0。底物特异性非常严格，反应平衡偏右，生物界中广泛发现，可从肝脏、心肌、骨骼肌中提纯，从心肌中提纯结晶化的延胡索酸酶分子量约20万，由四个多肽亚基构成，是三羧酸循环的酶，因此存在于线粒体基本结构中。具有严格的立体专一性，因此形成的苹果酸只有L-苹果酸

9、苹果酸脱氢酶

催化L-苹果酸和草酰乙酸相互转变的酶。以NAD+为氢受体，编号为EC1.1.1.37；以NADP+为氢受体，编号为EC1.1.1.82。

催化L-苹果酸脱氢并与草酰乙酸相互转化的酶。(EC1．1．1．37)。以NAD+作为电子受体。广义上也包括以NAD+或NADP+作为受体而生成丙酮酸和碳酸的苹果酸酶（EC1．1．1．38—40）。与NADP+也有弱反应，也可将其它羟酸脱氢。广泛存在于线粒体、细菌细胞膜上，为三羧酸循环中的一种酶。由于酶的来源不同，其某些性质也不一样。

苹果酸脱氢酶催化苹果酸氧化重新形成草酰乙酸，完成一轮柠檬酸循环

　　这是柠檬酸循环的最后一个反应，也是循环中的第4步氧化还原反应。L-苹果酸在以NAD＋为辅酶的苹果酸脱氢酶（malatedehydrogenase）催化下氧化生成草酰乙酸，同时NAD＋还原生成NADH反应是可逆的。　

糖有氧氧化分为两个阶段，第一阶段糖酵解途径的调节在糖酵解部分已探讨过，下面主要讨论第二阶段丙酸酸氧化脱羧生成乙酰-CoA并进入三羧酸循环的一系列反应的调节。丙酮酸脱氢酶复合体、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶复合体是这一过程的限速酶。?

　　丙酮酸脱氢酶复合体受别构调控也受化学修饰调控，该酶复合体受它的催化产物ATP、乙酰-CoA和NADH有力的抑制，这种别构抑制可被长链脂肪酸所增强，当进入三羧酸循环的乙酰-CoA减少，而AMP、CoA和NAD+堆积，酶复合体就被别构激活，除上述别位调节，在脊椎动物还有第二层次的调节，即酶蛋白的化学修饰，PDH含有两个亚基，其中一个亚基上特定的一个丝氨酸残基经磷酸化后，酶活性就受抑制，脱磷酸化活性就恢复，磷酸化-脱磷酸化作用是由特异的磷酸激酶和磷酸蛋白磷酸酶分别催化的，它们实际上也是丙酮酸酶复合体的组成，即前已述及的调节蛋白，激酶受ATP别构激活，当ATP高时，PDH就磷酸化而被激活，当ATP浓度下降，激酶活性也降低，而磷酸酶除去PDH上磷酸，PDH又被激活了。?

　　对三羧酸循环中柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的调节，主要通过产物的反馈抑制来实现的，而三羧酸循环是机体产能的主要方式。因此ATP/ADP与NADH/NAD+两者的比值是其主要调节物。ATP/ADP比值升高，抑制柠檬酸合成酶和异柠檬酶脱氢酶活性，反之ATP/ADP比值下降可激活上述两个酶。NADH/NAD+比值升高抑制柠檬酸合成酶和α－酮戊二酸脱氢酶活性，除上述ATP/ADP与NADH/NAD+之外其它一些代谢产物对酶的活性也有影响，如柠檬酸抑制柠檬酸合成酶活性，而琥珀酰-CoA抑制α-酮戊二酸脱氢酶活性。总之，组织中代谢产物决定循环反应的速度，以便调节机体ATP和NADH浓度，保证机体能量供给。