卞小莹武大雷张友明组合作首次工程化改造和

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非核糖体肽合成酶（Nonribosomalpeptidesynthases，NRPSs)是一类结构独特且功能多样的多模块巨型酶，能够对底物氨基酸进行特异地选择并按一定的顺序合成非核糖体肽。每个模块通常包含三个必需结构域即腺苷酰化(A)结构域、肽酰载体蛋白(PCP)结构域和缩合(C)结构域，负责将特定的单体缩合到新生成的肽链上。其中某些非核糖体肽的N端带有脂肪酸链，称为非核糖体脂肽，通常具有广泛的生物活性，如链霉菌来源的达托霉素和类芽孢杆菌来源的多粘菌素被认为是对抗革兰氏阳性菌和阴性菌感染的最后一道防线，而芽孢杆菌来源的表面活性素则是目前已知活性最强的生物表面活性剂。脂肪酸与聚肽链N端氨基酸的缩合一般是由起始缩合(Cs)结构域催化的，脂肪酸需要首先活化成辅酶A或酰基载体蛋白(ACP)形式，才能启动非核糖体脂肽的生物合成。脂肽的N端脂肪酸链可以进入细菌细胞膜的磷脂双分子层,对脂肽的生物活性和毒性都有重要的影响，因此改变脂肪酸链可提高脂肽成药属性，如达托霉素的创制。目前非核糖体肽聚肽骨架的组合生物合成研究取得显著进步，但却少有利用遗传操作对非核糖体脂肽的脂肪酸链进行改造的研究，究其原因是对Cs结构域装载脂肪酸链的特异性尚不明确。年1月12日，山东大学微生物技术重点实验室卞小莹课题组、武大雷课题组和张友明课题组联合在NatureCommunications上在线发表了题为EngineeringandElucidationoftheLipoinitiationProcessinNonribosomalPeptideBiosynthesis”的研究论文，该研究首先发现改造Cs结构域（结构域替换或点突变）能够改变非核糖体脂肽rhizomide，holrhizin和glidobactin的脂肪酸链，确立了一种改变脂肽脂肪酸链的策略。首次获得并解析了Cs结构域突变体（RzmA-CsRA）与其供体底物辛酰辅酶A的共结晶结构，鉴定了一系列控制脂肪酸链选择性的关键氨基酸位点，使得rhizomide的酰基链由乙酰基延长至十六烷酰基。而且，该研究阐明了在非核糖体脂肽的脂链启动过程中Cs结构域的三种不同构象，提出了此结构域“从底物结合到产物释放”的动态结构变化模型。该研究为非核糖体肽的脂链启动机制和工程化奠定了理论和实践基础。前期研究从同一株伯克氏菌Paraburkholderiarhizoxinica中发现了两类含有不同长度脂肪酸链的脂肽rhizomide和holrhizin。它们负责脂肪酸装载的Cs结构域显示了很高的同源度，但是装载脂肪酸链的长度却有较大差异(C2vsC8)。因此提供了一个可用于研究脂肪酸底物特异性的理想模型。作者首先利用Cs结构域交换发现能够成功改变前述两类脂肽的脂肪酸链，说明Cs结构域具有较高的脂肪酸链特异性，并因此确立了一种改变脂肽的脂肪酸链的遗传学方法，即全长Cs结构域交换定向改造脂肽的脂酰基链。并将该方法应用了来源于SchlegelellabrevitaleastrainDSM的脂肽glidobactinA（原始为带两个不饱和双键C12脂酰基的产物），将其与同源的glidopeptin合成基因簇的全长Cs以及前述异源的holrhizin的全长Cs进行交换后，均获得了高产的衍生物，证明了方法的有效性和普适性。图1非核糖体脂肽的生物合成以及利用Cs结构域替换改变rhizomide、holrhizin和glidobactin的脂肪酸链结构。随即经过序列比对发现了一个关键的氨基酸位点R，通过突变实验发现该氨基酸对脂肪酸链的长短具有决定性的作用。然后对RzmA-Cs结构域进行体外表达，并测试了该结构域及突变体与不同脂酰辅酶A的结合能力，成功获得了Cs结构域与供体底物辛酰辅酶A的共结晶结构（图2），在此基础上，结合关键位点的氨基酸突变（Q36，Y，R，Q和M），阐释了Cs结构域对脂肪酸链的选择机制，并进一步确定了负责脂肪酸链长度的其它关键氨基酸。对rhizomide而言，其Cs结构域中起决定性作用的氨基酸为Q36，Y，R，起辅助作用的氨基酸为Q及M，其中R位于结合口袋的入口位置，为第一个关键氨基酸，Q36，Y以及辅助位点Q，M均位于口袋内部。对口袋入口及进一步的口袋内部相应氨基酸的操纵，可以实现对脂肽脂酰基链的定向改造，在体内突变试验中也同步实现了rhizomide的脂肪酸链长度从乙酰基到十六烷酰基（C2-C16)的巨大改变，产生并鉴定了一系列的非天然脂肽。综上所述，该研究通过Cs结构域替换和关键氨基酸突变这两种手段对产物脂肽的脂肪酸链进行操纵，为非核糖脂肽的脂肪酸链改造提供了可行的策略和较为普适的方法，为复杂脂肽的组合生物合成和工程化改造奠定了理论和实践基础。本研究首次通过遗传改造(结构域替换和点突变)实现了非核糖体脂肽脂链的大幅改变，确立脂肽工程化改造的新策略，为复杂脂肽药物的研发提供了新的改造手段和策略。图2Cs结构域与供体底物辛酰辅酶A的复合物结构（a）显示控制脂肪酸链长度的关键氨基酸（b），并通过体外（c）和体内（d）实验改变改变脂肪酸长度。作者同时也获得了Cs结构域与供体底物辛酰辅酶A及受体底物氨基酸（L-Leu-SNAC）的三元复合物结构（图3），发现反应中心组氨酸H对两底物均具有稳定定位的作用，为Cs结构域的工程改造提供了重要信息。同时基于获得的多种不同构象Cs结构域的精细结构，提出其在催化脂链起始过程中存在的“从底物结合到产物释放”动态结构变化模型，进一步揭示了Cs结构域的催化机理。本研究首次阐释了Cs结构域在脂链起始中的独特构象变化，清晰地揭示了该结构域识别和催化两个底物的反应循环，完整阐明了非核糖体肽的脂链起始过程。图3Cs结构域与供体底物辛酰辅酶A及受体底物氨基酸（L-Leu-SNAC）的三元复合物结构（a,b）和Cs结构域的底物释放后的构象状态与未绑定底物的构象状态比较（c），以及Cs结构域催化脂链起始过程中存在的“从底物结合到产物释放”动态结构变化模型（d）。原文链接