促炎性和组织侵袭性T细胞琥珀酰辅酶A连接

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背景

类风湿性关节炎（RA）是由于缺乏自身耐受和生成自身抗体导致先天性和适应性免疫细胞侵入滑膜导致组织破坏的疾病。其中，致病性RACD4T细胞由于其细胞运动加剧以及侵蚀性膜褶皱结构导致其具有高的组织侵袭性和致炎性，这种细胞的异常行为可能是由于其线粒体耗氧和产生ATP的功能存在缺陷，而线粒体的功能与三羧酸（TCA）循环密切相关。研究人员发现RACD4T细胞中琥珀酸辅酶A连接酶的GDP形成β亚单位(SUCLG2)被抑制，进而出现代谢谱改变，T细胞微管蛋白修饰以及细胞形态、迁移性和致炎性的改变。研究将线粒体衰竭和乙酰辅酶A过载与类风湿性关节炎症联系起来。

SUCLG2缺陷型T细胞TCA循环的逆转

01

类风湿性关节炎患者的CD4T细胞由于线粒体ATP合成丧失ATP，处于能量缺乏状态，为了理解RACD4T细胞如何将ATP合成转化为代谢物质生成，研究人员量化了中间代谢产物并测定线粒体耗氧量。所有的实验中，从外周血单核细胞(PBMCs)中分离的CD4+CD45RA+T细胞被刺激72小时。银屑病关节炎(PsA)患者作为疾病对照组（PsA患者的T细胞代谢物浓度与健康受试者相似）。RAT细胞明显的TCA循环中间代谢产物明显累积(图1A-1D)，琥珀酸炎浓度下降一半，α-酮戊二酸、柠檬酸和乙酰辅酶A浓度显著上升。琥珀酸/α-酮戊二酸的比例在健康T细胞中约为10，在RAT细胞中降至2。提示了还原羧化反应和逆向TCA循环现象。Seahouse技术比较了健康和RAT细胞的线粒体氧消耗率，RACD4T细胞基础耗氧率减少40%(图1F)，最大呼吸和ATP相关的耗氧减少了50%(图1G和1H)，而备用呼吸能力没有变化(图1I)。同时，RAT细胞线粒体膜电位降低(图1J)。表明RAT细胞线粒体功能障碍，影响氧化磷酸化和丙酮酸氧化的能量产生。研究人员进而对13种TCA循环相关酶进行了转录分析(图1K)。编码DLD和SUCLG2成分的转录物在RAT细胞中被显著抑制(图1L)。免疫印迹法显示RAT细胞中SUCLG2蛋白浓度显著降低(图1M)，且酶活性水平上，琥珀酰辅酶a合成酶(SCS)催化活性低于对照组50%(图1N和1O)。对RA和巨细胞动脉炎中驻留组织的T细胞的免疫荧光比较表明，在巨细胞动脉炎T细胞中SUCLG2蛋白表达强烈，在RAT细胞中信号持续较低(图1P)。

上述数据表明RAT细胞中的线粒体缺陷，氧化磷酸化和还原羧化的阻断，TCA循环逆转。α-KG转化为琥珀酸所需的两种连接酶的转录抑制引起RAT细胞显著的乙酰辅酶A高、柠檬酸高、琥珀酸低的代谢特征。

图1RAT细胞线粒体琥珀酸辅酶A连接酶（SUCLG2）的抑制作用

类风湿性关节炎(RA)、银屑病关节炎(PsA)患者和年龄匹配的健康个体的CD4+CD45RA+T细胞被刺激72小时。线粒体代谢物琥珀酸盐、α-KG、柠檬酸盐和乙酰CoA的细胞内浓度(A–D)。海马分析仪测量的线粒体耗氧率（E-I）。MitoTrackerRed染色，流式细胞术测量线粒体膜电位（J）。RT-PCR定量13种TCA循环酶的转录物（L）。WB分析T细胞中琥珀酸辅酶a连接酶GDP形成β亚单位(SUCLG2)（M）。琥珀酰辅酶a合成酶活性分析，催化反应的实时OD值(N)，酶活性（O）。类风湿性滑膜炎(上)和巨细胞动脉炎(下)组织切片中CD3和SUCLG2的双重免疫荧光染色（P）。

SUCLG2功能丧失足以产生类风湿性关节炎T细胞的代谢表型

02

为了研究RAT细胞呼吸受损和代谢产物产生转移是否是由SUCLG2缺乏引起的，研究人员首先用siRNA在健康T细胞中部分沉默SUCLG2，再现了RAT细胞的表型，结果表明健康T细胞中的氧消耗对SUCLG2敲除高度敏感(图2A–2C)，基础氧消耗减少了50%以上，最大呼吸减少了70%。同时SUCLG2功能丧失降低了细胞内琥珀酸水平(图2D)，促进了乙酰辅酶A的积累(图2E)。相反，研究人员用表达SUCLG2的质粒转染RAT细胞，修复缺损的SUCLG2的表达，结果发现显著增强线粒体呼吸(图2F-2H)，琥珀酸水平提高（图2I）及乙酰辅酶A水平降低（图2J）

上述数据表明RAT细胞中SUCLG2功能丧失导致严重的代谢表型，原因在于SCS在产生琥珀酸、提供电子传递链和调节细胞内乙酰辅酶A库中的关键作用。

图2SUCLG2调节线粒体活性和细胞内乙酰辅酶A库

SUCLG2通过siRNA转染在健康T细胞中被敲除或通过质粒转染在RAT细胞中过表达。48小时后检查细胞。海马分析仪测量耗氧率（A-C）。SUCLG2敲除后健康T细胞内琥珀酸和乙酰辅酶A的浓度（D和E）。SUCLG2在RACD4T细胞中过表达，海马分析仪测定线粒体耗氧率（F-H）。SUCLG2过表达后RACD4T细胞内琥珀酸和乙酰辅酶A浓度（I和J）

SUCLG2缺乏的T细胞具备致炎性

03

CD4T细胞是类风湿性组织炎症的关键驱动因素。为了在机制上联系滑膜T细胞的SUCLG2表达和功能行为，研究人员开发了一个人滑膜-NSG小鼠嵌合体模型。之前文献表明将RAPBMCs转移至转接了人滑膜组织的NSG小鼠可导致滑膜炎。因此研究人员用对照质粒或表达SUCLG2的质粒转染至从RAPBMCs中提取的RACD4T细胞（图3A）。HE染色表明在RACD4T细胞中选择性地使SUCLG2表达正常化减轻了其促炎潜能，显著降低了组织浸润的密度(图3B)。由于滑膜炎的强度与产生IFN-γ的T细胞的存在密切相关，研究人员通过CD3/IFN-γ双色免疫荧光定量组织切片中的IFN-γ+T细胞。在转移的RACD4T细胞中选择性地重建SUCLG2显著降低了滑膜组织内IFN-γ+T细胞的丰度(图3C和3D)。病变的滑膜组织内TCR、TBET和RORG转录物的高表达，表明其中的T细胞属于Th1或Th17谱系(图3E)。同时，接受对照质粒转染的RAT细胞-人滑膜-NSG小鼠的滑膜组织含有大量炎症因子转录物，包括IFNG、IL17和IL21(图3F)。在恢复RACD4T细胞中SUCLG2的表达显著降低组织内TCR、TBET、RORG的表达及其他炎症因子转录物(图3F)。抗炎细胞因子白介素-10和TGF-β没有变化。

综上所述，SUCLG2缺陷的T细胞诱导组织炎症，纠正这种代谢缺陷有助于重建组织保护。

图3线粒体酶SUCLG2具有组织保护作用

滑膜组织切片HE染色（B）。滑膜外植体中IFN-γ和CD3的免疫荧光共染色（C）。在每个滑膜外植体中组织驻留IFN-γ+CD3+T细胞的计数（D）。RT-PCR检测组织提取物中的TRB、TBET和RORG转录物及关键炎症标志物的基因表达谱（E和F）。

过量乙酰辅酶A导致微管蛋白超乙酰化

04

DLD和SUCLG2缺乏和TCA循环逆转的主要代谢结果是柠檬酸盐和乙酰辅酶A的积累，过量的乙酰辅酶A可能促进微管蛋白的乙酰化，使微管结构稳定。为考察RAT细胞中多余的乙酰辅酶A的额外功能结果，研究人员对CD4T细胞中的乙酰化微管蛋白(Ac-微管蛋白)进行了定量(图4A-4F)。细胞荧光分析显示在受刺激的CD4T细胞中很容易检测到Ac-微管蛋白，并且在RAT细胞中一直处于较高的丰度。α-微管蛋白K40乙酰化的流式细胞术显示RAT细胞中的浓度明显较高(图4B)。WB分析显示乙酰化微管蛋白在RAT细胞中的含量是对照细胞的两倍多(图4D)。单细胞免疫荧光显示几乎50%的RAT细胞有高Ac-微管蛋白表达(图4F)。微管蛋白的主要乙酰转移酶是α-微管蛋白乙酰转移酶-1(ATAT1)，HDAC6是相应的脱乙酰酶。RT-PCR结果显示对照和类风湿性关节炎T细胞表达相似的转录水平(图4G)，排除酶丰度是微管蛋白超乙酰化的关键因素。

研究人员测试SUCLG2的表达是否能改变微管细胞骨架。在健康的T细胞中SUCLG2敲除显著增加微管蛋白乙酰化(图4H-4I)。AcCoAhighRAT细胞中SUCLG2的恢复防止了微管蛋白超乙酰化(图4J-4K)。抗霉素A/鱼藤酮对线粒体的抑制迅速增加细胞内的Ac-微管蛋白(图4L-4N)。硫辛酸是丙酮酸脱氢酶复合物的辅因子，并增强线粒体乙酰辅酶A的产生。在富含硫辛酸的培养基中培养健康的T细胞可增强细胞中的Ac-微管蛋白(图4O–4Q)。线粒体柠檬酸盐输出需要柠檬酸盐转运蛋白(CTP)。用CTP抑制剂CNASB干预RAT细胞可迅速减少微管蛋白乙酰化(图4R-4T)。

因此，SUCLG2缺乏细胞中乙酰辅酶A的过量依赖于柠檬酸盐转运，并导致微管系统的超乙酰化。

图4RAT细胞微管蛋白超乙酰化

微管蛋白乙酰化的细胞荧光分析（A和B）、免疫印迹分析（C和D）、共焦成像（E）。50个T细胞的荧光强度定量（F）。RT-PCR检测对照及RA中的ATAT1和HDAC6转录物（G）。流式检测用对照siRNA或SUCLG2siRNA转染的健康CD4T细胞中乙酰化微管蛋白（H和I）。SUCLG2过表达后RACD4T细胞中的微管蛋白乙酰化（J和K）。分别用抗霉素A/鱼藤酮(5nM)处理、硫辛酸处理处理的健康CD4T细胞的乙酰化微管蛋白的细胞荧光和共聚焦显微图像（L-Q）。CTP抑制剂CNASB(mM)处理的RAT细胞的乙酰化微管蛋白的细胞荧光和共聚焦显微图像（R-T）。

微管蛋白超乙酰化增强T细胞运动性和组织侵袭性

05

为了从机制上将乙酰辅酶A诱导的超乙酰化与迁移行为联系起来，研究人员比较了健康和RAT细胞在3D胶原凝胶和跨孔迁移试验中的侵袭能力。RAT细胞比对照细胞更有效地进入胶原基质并渗透到更深层(图5A-5C)。在跨孔室中，与对照组相比，RAT细胞迁移是正常的两倍(图5D)。研究人员比较了迁移性(下腔室)和非迁移性(上腔室)T细胞中Ac-微管蛋白的浓度，流式和共聚焦检测显示，迁移的T细胞群始终具有较高的Ac-微管蛋白水平(图5F-G)。ATAT1敲除表明侵袭能力依赖于微管蛋白乙酰化(图5H-5J)。

为了研究体内组织侵袭，研究人员开发了图3所示的人源化小鼠模型。在转移到人滑膜-NSG嵌合体之前，用ATAT1或对照siRNA转染PBMCs。对滑膜组织RT-PCR分析显示对照组所有组织外植体中均有高表达的INF、IL17、IL1B、IL6和TNFA转录物。谱系决定转录因子TBX21和RORC强烈上调。用ATAT1siRNA转染的PBMCs重建的小鼠组织转录组分析显示基本上所有炎症基因转录物的丰度较低(图5K)。此外，组织浸润性T细胞的密度显著降低(图5L)。组织切片的免疫组织化学染色证实了ATAT1沉默的抗炎作用。对照移植物含有致密的T细胞浸润，而ATAT1敲除后T细胞密度显著降低(图5M和5N)。组织侵袭性T细胞通常成簇排列，类似于类风湿性滑膜炎。T细胞聚集在对照移植物中典型，在ATAT1沉默丧失后更少发生(图5O)。

这些实验表明稳定的微管蛋白与T细胞组织侵袭性、线粒体完整性与细胞骨架功能的耦合关系、T细胞适应性有关。

图5微管蛋白超乙酰化促进T细胞迁移

患者和对照组的CD4+CD45RA+T细胞被刺激72h。3D胶原基质中CD4T细胞的侵袭性，共聚焦显微镜测量DAPI染色的细胞核（A-C）。活化的CD4T细胞在跨孔中迁移24小时的细胞百分比（D）。Ac-微管蛋白特异染色上、下腔室的T细胞（E-G）。RAT细胞ATAT1敲除后3D胶原基质中CD4T细胞的侵袭性（H-I）。RAT细胞ATAT1敲除后跨孔试验中迁移的T细胞百分比（J）。将植入人滑膜组织的NSG小鼠用转染了对照或ATAT1siRNA的RAPBMCs重建。移植的滑膜移植物免疫组织化学染色和组织转录组分析(K-O)。

SUCLG2缺乏细胞形状改变和尾足形成

06

研究人员测量高尔基体-细胞核的距离来测试RAT细胞是否形成分离的亚细胞区室。在胶原蛋白包被的表面，Ac-TubulinhighRAT细胞自发伸长，产生5毫米的平均高尔基体-核距离（图6B）为了描述T细胞极化对Ac微管蛋白的依赖性，研究人员敲除了ATAT1。在ATAT1loT细胞中，高尔基体位于离细胞核不到1毫米的地方，结果可以将高尔基体的运动与微管蛋白联系起来(图6C和6D)。

为优化细胞运动的条件，研究人员将健康和RAT细胞置于内皮单层上(图6E和6F)。大多数健康的T细胞呈圆形，平均圆形指数为0.85(1.0表示理想圆形)。相反，类风湿性关节炎T细胞自发形成圆形指数为0.65的延长表型。细胞形状依赖于Ac-微管蛋白，ATAT1敲除后，大多数RAT细胞聚集，平均细胞圆形度从0.7变为0.82(图6G和6H)。

综上所述，这些数据揭示了RAT细胞中TCA循环逆转导致过量乙酰辅酶A的产生，调节前部和后部细胞骨架元件，改变了细胞形状和细胞器位置，形成尾足。

图6微管蛋白超乙酰化促进T细胞尾足形成

患者和对照组的CD4+CD45RA+T细胞刺激72小时，并接种在胶原涂层表面（A-D）或内皮细胞单层（E-H）。高尔基体标记物GM-(绿色)、Ac微管蛋白(红色)和细胞核(DAPI)的共免疫荧光染色（A-B）。对照或ATAT1siRNA转染RACD4T细胞，GM-(绿色)染色（C-D）。对照和RAT细胞中T细胞圆形度的定量（E-F）。ATAT1敲除后扩散的T细胞中细胞圆形度的代表性显微照片和定量（G-H）。

SUCLG2缺乏和微管蛋白超乙酰化促进核周线粒体聚集

07

研究人员测试了微管乙酰化是否影响线粒体的位置。HSP60+线粒体在对照组和RAT细胞中的分布有根本不同，在RAT细胞中，线粒体极化，与乙酰化微管蛋白共定位。在健康的T细胞中，线粒体广泛分布在细胞质中(图7A)。研究人员将细胞分成八个部分并比较信号强度，建立了线粒体极化指数。单细胞分析表明RAT细胞倾向于将线粒体置于核周簇中(图7B和7C)。用线粒体抑制剂抗霉素/鱼藤酮处理T细胞，线粒体重新分布到核周边缘(图7D和7E)。为了证明微管与线粒体定位有关，研究人员敲除ATAT1发现微管蛋白乙酰化减少使线粒体分散在细胞质中(图7F和7G)。通过ATAT1过表达或硫辛酸治疗促进健康T细胞中微管蛋白的超乙酰化，模拟了RAT细胞中线粒体的分布模式(图7H-7K)。

数据表明RAT细胞中TCA方向性转变、乙酰辅酶A产生和细胞骨架的翻译后修饰在控制线粒体在核周位置中的作用。

图7微管蛋白超乙酰化导致RACD4T细胞线粒体聚集

类风湿关节炎患者和对照组的CD4+CD45RA+T细胞被激活72小时，并用线粒体标记HSP60染色。Ac-微管蛋白和HSP60染色的代表性共焦图像(3D最大模式)(A)。HSP60染色单个细胞的共聚焦图像（B、D、F、H、J）。健康和RAT细胞线粒体极化指数（C、E、G、I、K）。

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总结

研究人员发现RACD4T细胞中琥珀酸辅酶A连接酶的GDP形成β亚单位(SUCLG2)被抑制。TCA循环从氧化向还原方向逆转，α-酮戊二酸、柠檬酸和乙酰辅酶A累积。过量的乙酰辅酶A使病变的CD4T细胞微管蛋白乙酰化，细胞微管骨架稳定，线粒体被定位在核周位置，进而极化、形成尾足、迁移及侵袭组织。通过补充SUCLG2及敲除微管蛋白乙酰转移酶（ATAT1）则可以抑制T细胞的炎性化分化，减轻滑膜炎症。这些数据增加了代谢干扰可以针对T细胞关键异常的可能性，并代表了一种潜在的免疫调节治疗新策略。

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