基于化学蛋白质组学技术系统分析酰基辅酶A

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酰基辅酶A（acyl-coenzymeA，acyl-CoA）是脂肪酸与辅酶A形成的一类硫酯化合物（图1），是机体重要的内源性代谢物，与脂质合成、能量代谢和蛋白乙酰化等多种生命活动密切相关，而目前尚未有大规模酰基辅酶A-蛋白相互作用研究。传统研究手段如免疫印迹法（Westernblot）、免疫共沉淀（Co-IP）等难以有效捕捉像酰基辅酶A-蛋白这类瞬时、微弱的相互作用，且分析通量较低。为解决上述问题，该文作者整合化学蛋白质组学技术和多种数据分析方法，建立了酰基辅酶A-蛋白相互作用分析技术（CoA/AcetyTraNsferaseInteractionProfiling，CATNIP，图2），并在HeLa细胞中系统分析了酰基辅酶A和蛋白的相互作用。

图1酰基辅酶A的结构及其对蛋白功能的影响

图2基于化学蛋白质组学技术的酰基辅酶A-蛋白相互作用实验流程图（CATNIP）

首先，作者设计了表面键合辅酶A类似物（Lys-CoA）的琼脂糖珠（Sepharose）作为亲和富集平台（图3）。参与构成亲和富集平台的每个琼脂糖珠表面都键合有多个辅酶A类似物，可高效地从HeLa细胞裂解液中直接捕获相互作用蛋白，使生理状态下瞬时、微弱的酰基辅酶A-蛋白相互作用被有效捕捉。作者同时设置乙酰辅酶A预孵育浓度分别为3μmol/L、30μmol/L和μmol/L的3个竞争组。

图3表面键合辅酶A类似物琼脂糖珠的合成路线

随后，作者应用定量蛋白质组学技术识别和鉴定上述4组样本（n=3）中的差异蛋白。为提高蛋白鉴定覆盖度并识别低丰度的蛋白，作者结合强阳离子交换色谱和C18反相色谱对酶切后的肽段进行多维色谱分离。定量蛋白质组学分析使用ThermoLTQ线性离子阱质谱仪，采集模式为数据依赖型采集模式（DataDependentAcquisition，DDA），采用非标定量并以蛋白质长度作为校正因子对数据进行归一化处理，最终成功采集了超过万张之多的多肽图谱，有效地提高了蛋白质组学数据质量。

接下来，作者采用t-SNE方法降维和聚类蛋白质组学分析所鉴定的蛋白。作为一种非线性降维方法，t-SNE方法相较于主成分分析（PCA）等线性降维方法能够提供更好的聚类结果，但其在数据运算上往往需要更长的时间。结果表明，蛋白经t-SNE降维后可被聚类为8组（Cluster）（图4A），其中Cluster1、2、3中的蛋白在整体上表现出对乙酰辅酶A竞争的浓度依赖性（图4B）。通过对各组蛋白进行功能注释（GO分析），作者发现Cluster1、2、3中的蛋白是酰基辅酶A相互作用蛋白的可能性明显高于其他5组（图5）。

图4经蛋白质组学分析鉴定的蛋白的t-SNE降维聚类结果

A：t-SNE将蛋白降维聚类为8组；B：8组蛋白对乙酰辅酶A竞争的浓度依赖性分析结果

图5t-SNE聚类的各组蛋白的比例和GO功能注释

A：各组蛋白中已知的酰基辅酶A相互作用蛋白占该组全部蛋白的比例；B：Cluster1和Cluster2中蛋白的GO分析结果

鉴于生物体内酰基辅酶A结构多种多样，为研究不同酰基辅酶A与蛋白相互作用的选择性，作者进一步比较了6个酰基辅酶A类代谢物与蛋白的相互作用轮廓，这6个酰基辅酶A分别为辅酶A（CoA）、乙酰辅酶A（acetyl-CoA）、乙酸辅酶A（acetic-CoA）、丁酰辅酶A（butyryl-CoA）、巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）和棕榈酰辅酶A（palmitoyl-CoA），具体结构见图6A。使用上述亲和富集平台和蛋白质组学流程分别识别和鉴定6个酰基辅酶A的相互作用蛋白，结果如图6B和6C韦恩图所示。这一结果表明，不同酰基辅酶A与蛋白的相互作用存在一定的选择性，但主要表现为杂泛性（总体蛋白轮廓相近）。

图6不同酰基辅酶A类代谢物与蛋白的相互作用分析

A：6个酰基辅酶A类代谢物的化学结构；B：乙酰辅酶A与其他5个酰基辅酶A类代谢物相互作用蛋白比较；C：乙酸辅酶A、丁酰辅酶A、巴豆酰辅酶A和棕榈酰辅酶A相互作用蛋白比较

最后，作者采用拓扑数据分析（TDA）揭示了蛋白质组学分析所鉴定的高可信度蛋白的网络特征（图7A）。该研究中高可信度蛋白的筛选标准为：（1）该蛋白至少能够被一个酰基辅酶A类代谢物竞争；（2）实验组与竞争组的差异倍数（FoldChange）≥4且FDR≤0.05；（3）该蛋白未被污染物数据库（CRAPome）收录，用以排除琼脂糖珠亲和捕获时可能产生的假阳性。拓扑数据分析帮助作者发现了许多新的与酰基辅酶A发生相互作用的蛋白类型，例如，RNA代谢相关蛋白以及细胞周期相关的蛋白（图7B），这些蛋白可能直接或间接地与酰基辅酶A结合并受其代谢调控。

图7拓扑数据分析（TDA）揭示高可信度蛋白的网络特征

A：高可信度蛋白筛选流程；B：高可信度蛋白的TDA分析结果

综上，作者基于化学蛋白质组学技术在HeLa细胞中系统识别了酰基辅酶A与蛋白的相互作用特征，并采用t-SNE聚类分析和拓扑数据分析（TDA）识别相互作用蛋白的网络特征。高质量的蛋白质组学数据结合先进的数据挖掘工具和数据分析技术，高效识别酰基辅酶A相互作用蛋白，对酰基辅酶A类代谢物生物学功能的进一步研究具有重要意义。

参考文献

LevyMJ,MontgomeryDC,SardiuME,etal.Asystemschemoproteomicanalysisofacyl-CoA/proteininteractionnetworks[J].cellchemicalbiology,,27(3):-.

文献整理：马聪玉；编辑：生宁、张金兰；第期

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