CRISPRi代谢研究领域的新宠儿

Fig.1Screeninggenetictargetstoredirectthecarbonfluxtowardmalonyl-CoA

CRISPRi是一种利用无剪切活性的CRISPR/dCas来实现沉默目的基因表达的方法。相比于传统的基因敲除策略，CRISPRi系统在对必需基因操作方面有着明显的优势，相较于RNAi策略，其靶向更加精确，导向系统RNA更易获得。

类黄酮是一种高价值的天然产物，因其良好的抗病毒、抗癌等生物化学特性而被广泛用于人类健康和营养方面。(2S)-柚皮素是大多数类黄酮化合物的共用前体，L-酪氨酸自酪氨酸胺裂解酶(TAL),4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)，查尔酮合酶(CHS)和查尔酮异构酶(CHI)四步步催化反应形成(2S)-柚皮素，其中，每形成一摩尔(2S)-柚皮素需要3摩尔丙二酰辅酶A,丙二酰辅酶A的大量需求对宿主菌大肠杆菌来讲是个沉重的负担。

日前，学术杂志ScientificReports刊登了江南大学陈坚教授课题组在工程大肠杆菌中利用CRISPRi方法寻找靶点提高类黄酮产量的研究成果。

乙酰辅酶A的供应决定了丙二酰辅酶A的合成，同时细胞自身的脂肪酸合成也会消耗丙二酰辅酶A，与类黄酮途径形成碳流竞争。基于这些分析，作者使用CRISPRi系统对乙酰辅酶A合成涉及的zwf，pgl，tpiA，ppsA，eno，glyA，fold；乙酰辅酶A消耗涉及的mdh，fumC，sdhABCD，sucCD，sucA，sucB，citE，gdhA，gltP，adhE；丙二酰辅酶A消耗涉及的脂肪酸合成途径中的fabH，fabB，fabF，fabG，fabA，fabI，fabD等候选靶点基因进行了鉴定。

通过检测胞内乙酰辅酶A及丙二酰辅酶A的增长幅度，第一轮操作结果显示ppsA,eno,adhE，mdh，fumC，sdhA，sucC，citE下调后丙二酰辅酶A均提高超过%，此外，fabH,fabB,fabF和fabI的下调后乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的提高均超过%。这些被选为后续靶点基因。

为了较好的协调细胞生长和高产丙二酰辅酶A，作者对第一轮获得靶点基因分别进行了“高-中-低”三种不同CRISPRi程度的比较，此轮结果显示，高度抑制fabF基因，分别中度抑制sucC，fumC和低程度抑制eno,adhE,mdh,fabB均可显著提高丙二酰辅酶A的供应。

通过对上述获得的eno,adhE,mdh,fabB,fabF,sucC和fumC靶点基因进行组合操作，最终发现anti-fabF/fumC/fabB/sucC/adhE的组合表型最好，柚皮素的产量为.6mg/L，较起始提高7.4倍。

该研究为CRISPRi在大肠杆菌代谢工程靶点鉴定提供了策略参考，同时该成果亦可用于提高其他丙二酰辅酶A源下游产物的产量。

（来源：生物催化设计与改造服务）