降解与抑制克服他汀类药物引起的羟甲基戊二

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研究背景

羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)是体内催化胆固醇从头合成的关键酶，其活性大小直接影响着胆固醇合成的速度，影响着体内胆固醇含量的高低。HMGCR是在胆固醇生物合成途径中催化HMG-COA转化为甲羟戊酸的限速酶，位于内质网，是他汀类药物的作用靶点。他汀类药物是一类最常用于预防和治疗心血管疾病的降胆固醇药物。由于具有HMG样结构，他汀类药物可以竞争性地与酶的活性位点结合，阻断甲羟戊酸和包括胆固醇在内的下游衍生物的生成。在市场上各种类型的他汀类药物中，阿托伐他汀(立普妥）在降低血浆低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平和减少心血管方面的不良反应已显示出卓越的功效。虽然他汀类药物可以通过抑制HMGCR活性来降低胆固醇的生物合成，但在包括人类在内的几种动物的肝脏中，常常会发生蛋白的代偿性增加。骨骼肌损伤，肝毒性。神经毒性也是他汀类药物主要的副作用。

在这项研究中,作者设计合成了由阿托伐他汀与E连接酶配体CRBN构成的PROTAC。作者发现,P22A是降解内源性HMGCR蛋白质能力最强的PROTAC。且以CRBN依赖的方式诱导HMGCR泛素化，P22A介导的HMGCR降解需要形成HMGCR/PROTAC/CRBN复合物。在人肝癌Huh7细胞中，P22A诱导的HMGCR蛋白升高远低于阿托伐他汀诱导的HMGCR蛋白升高。该化合物还可以激活固醇调节元件结合以并阻断内源性胆固醇的生成。

实验结果

作者首先试图构建一个靶向降解HMGCR的PROTAC库。阿托伐他汀可以识别HMGCR结合口袋。作者将叠氮标记的聚乙二醇(PEG)安装在泊马度胺的胺基上，将烷基标记的PEG安装在暴露于溶剂中的阿托伐他汀苯环上(红色箭头所示）。通过免疫印迹法评价每一种PROTAC的降解能力。作者发现，基于CRBN的PROTAC可以有效的诱导HMGCR降解。

Fig1

为了优化HMGCR-PROTACs的药效并研究其构效关系，作者进一步设计合成了不同的HMGCR-PROTACs。

Fig2

PROTAC诱导HMGCR降解的评价。已知高甾醇水平可诱导HMGCR蛋白的膜结构域与内质网的Insig-1和Insig-2蛋白结合，导致其快速降解。为了排除由Insig介导的HMGCR降解的干扰，作者使用了同时缺乏Insig1和Insig2的SRD15细胞进行研究。与亲代CHO细胞相比，SRD15细胞在正常培养基中生长时，内源性HMGCR蛋白水平明显升高。此外，阿托伐他汀在CHO细胞诱导HMGCR蛋白的剂量依赖性增加，而在SRD15细胞中未诱导HMGCR蛋白的剂量依赖性增加。结果说明SRD15细胞适合在体外评价原蛋白介导的HMGCR降解。

Fig

作者评价了PROTAC对SRD15细胞的降解能力。用碳原子取代氧的新系列(化合物12a-12g)，碳的取代增加了PROTAC的疏水性，以及膜渗透性。然而，与化合物P22A相比，该碳取代系列的DC50值没有改善。1a-1f诱导HMGCR降解的能力低于P22A，其中1d的降解能力最强。对于使用烷基取代的泊马度胺(化合物14a-14f），长链的(化合物14d-14f)在降解HMGCR方面优于短链的(化合物14a-14c)。化合物P22A的降解能力是该PROTAC库中最强的。

Fig4

P22A通过CRBN-E泛素连接酶复合物促进HMGCR降解。P22A诱导HMGCR的降解以剂量依赖性的方式,当P22A的浓度达到1μM，70%的HMGCR被降解。作者将SRD15细胞与P22A、蛋白酶体抑制剂MG12和泛素化抑制剂MLN-进行孵育。结果发现加入MG12或MLN-完全阻断p22A诱导的HMGCR降解。由于阿托伐他汀与泊马度胺对P22A产生竞争，HMGCR的降解效果也受到抑制。结果表明P22A通过泛素-蛋白酶体系统诱导HMGCR蛋白的降解。

Fig5

P22A能够阻断胆固醇的生物合成。为了监测内源性HMGCR在活细胞中的实时降解，制备了一种GFP标记的HMGCR编码结构。用P22A处理的细胞GFP强度消失。作者推断P22A通过阿托伐他汀抑制HMGCR活性，同时通过泊马度胺部分诱导HMGCR降解，从而一步降低细胞中甾醇水平。事实上，与阿托伐他汀相比，P22A处理的Huh7细胞中HMGCR蛋白的代偿性增加明显减弱。作者还检测了HMGCR和LDLr(低密度脂蛋白受体)这两个与胆固醇代谢的有关靶点。P22A对HMGCR和LDLr的影响相比于阿托伐他汀略有增加。尽管P22A减少了胆固醇从头合成，但总中性脂类(胆固醇酯和甘油三酯)并没有改变。

Fig6

P22A和阿托伐他汀在蛋白组学水平上的干预作用不同。作者进行了蛋白质组学研究，以比较阿托伐他汀抑制和P22A降解之间的蛋白表达谱差异。在主成分分析图中，DMSO、阿托伐他汀和P22A个组在不同的区域内聚集。通过对整个蛋白质组的方差分析发现。共有个表达水平不同的蛋白质，根据其归一化丰度可进一步分为4个簇。通过Insig-介导的内质网相关性降解途径降解HMGCR的机制与PROTAC诱导的降解有很大的不同。

Fig7

总结与展望

羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)是内质网中的一种八通道跨膜蛋白，是治疗血脂异常重要的药物靶点。著名的他汀类药物阿伐他汀（立普妥）一直被广泛用于心血管疾病的预防和治疗。然而，他汀类药物可引起HMGCR蛋白的代偿性上调,还会引起如骨骼肌损伤之类的不良反应。作者基于蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)的思想，使用PROTAC技术来敲降HMGCR蛋白。P22A可有效降低HMGCR蛋白水平，阻断胆固醇生物合成，且HMGCR的代偿性上调较少。与Insig介导的HMGCR降解途径相比，PROTACs利用E连接酶降解内源性和体外表达的HMGCR。P22A的他汀部位抑制HMGCR活性，降低下游甾醇，从而导致细胞中HMGCR蛋白代偿性增加,另一方面，泊马度胺部位招募E泛素连接酶CRBN来降解HMGCR。与传统的小分子抑制剂(如他汀类药物)相比，PROTAC有可能作为一种有效的方法来解决不良反应、耐药性和蛋白质的代偿性上调等问题。该篇工作为治疗高胆固醇血症和心血管疾病提供了一种新的策略。

本文于年4月22日发表于JMC上，第一作者是杨毅庆和李美欣，通信作者是饶燏教授、宋保亮教授，清华大学和武汉大学为通信单位。