JournalClub胡灏,

多发性骨髓瘤是种常见的血液系统恶性肿瘤。即使采用先进的治疗方法，骨髓瘤患者的半数生存期也停滞在5到7年，治愈仍然遥遥无期。有研究报道称高BMI与骨髓瘤的发病率、不良预后以及从无症状良性阶段向恶性阶段的转变呈正相关[1,2]。这些研究表明肥胖在病因上与骨髓瘤的发病机制有关。

乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）是一种重要的代谢产物，在许多细胞过程中发挥着作用——它是丙酮酸进入三羧酸循环的代谢中间体，是脂肪酸从头合成的关键前体，也是赖氨酸乙酰化的唯一乙酰基供体[3]。醋酸盐生产乙酰辅酶A主要依赖于乙酰辅酶A合成酶2（ACSS2）。在缺氧、缺糖、低血清等代谢应激条件下，ACSS2可通过产生乙酰辅酶A，促进某些实体瘤的恶性细胞生长，进一步进入代谢途径或作为蛋白质乙酰化的供体[4,5]。然而，ACSS2在骨髓瘤发病机制中的作用，特别是在肥胖诱导的骨髓瘤进展中的作用尚不明确。

年12月11日，美国德克萨斯州休斯敦卫理公会癌症中心的ZongweiLi教授课题组在CellMetabolism杂志上发表题为”Acetyl-CoASynthetase2:ACriticalLinkageinObesity-InducedTumorigenesisinMyeloma”的文章。我作为一名精准医学北斗科研小组的大三学生，很荣幸为大家分享这篇文献。

BOOK

在这项研究中，作者调查了肥胖在骨髓瘤患者代谢重编程中的作用。通过分析肥胖患者中分离的恶性浆细胞，确定了乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）的代谢过程在肥胖相关骨髓瘤生长中的显著作用。作者发现在肥胖骨髓瘤患者中，ACSS2的表达显著升高，且ACSS2水平升高与BMI值（身体质量指数）呈正相关。作者还发现骨髓瘤细胞表达的ACSS2通过增强致癌蛋白——干扰素调节因子4（IRF4）的稳定性而促进骨髓瘤的发生。因此，该研究表明ACSS2在肥胖诱导的骨髓瘤生长中起中心作用，并揭示了肥胖与骨髓瘤发病之间的机制联系。

由于作者的研究方向是探究肥胖对于骨髓瘤的影响，所以先利用微阵列技术筛选了9例骨髓瘤患者的CD恶性浆细胞基因表达谱，并对BMI25和BMI30的患者进行差异基因表达分析，发现存在个差异基因。经基因富集分析分类后，可以观察到差异最大的途径是炎症反应和代谢过程。众所周知，代谢重编程是癌症发展的重要标志，于是作者选择了代谢途径做进一步研究，结果显示乙酰辅酶A的代谢过程与其他代谢途径又存在显著的差异。生物信息学分析显示ACSS1/2在肥胖患者中呈高表达，而ATP-柠檬酸裂解酶（ACLY）和丙酮酸脱氢酶（PDH）则呈低表达，因此作者推测，在肥胖的压力下，骨髓瘤细胞可能更依赖于醋酸盐途径产生的乙酰辅酶A。接下来，作者用22例骨髓瘤患者的细胞，做了qPCR和免疫组化分析，结果表明，ACSS1/2的mRNA和蛋白水平在肥胖患者中均上调，且mRNA水平与BMI值呈显著的正相关。进一步，为了证明ACSS1/2的临床相关性，利用Kaplan-Meier分析预后生存曲线，得知ACSS2高表达的患者比低表达的患者预后差，但ACSS1的表达高低却没有预后的差异。作者根据文献，将多发性骨髓瘤分为7个分子亚型，显示预后不良的亚型的ACSS2表达量明显高于4个预后良好的亚型，且ACSS1也没有发现差异。因此，综合上述实验结果，作者最终选择了ACSS2作为下一步研究的主要对象。（Figure1）

Figure1

由上述可知，在肥胖骨髓瘤患者中ACSS2高表达，且与临床结果相关。作者接着选用C57BL小鼠，分别采用正常饲料和高脂饲料喂养，再同时皮下注射骨髓瘤细胞，用ACSS2抑制剂治疗2天后进行样品的收集，并测定了小鼠体重、IgG2b浓度、骨髓和脾脏中CD阳性浆细胞的百分比的变化等多发性骨髓瘤的诊断指标。研究说明肥胖小鼠的多发性骨髓瘤相应指标均比正常小鼠高，而在抑制ACSS2后指标均下降。5TGM1小鼠模型是一种多发性骨髓瘤临床前模型，作者在饲育8周后观察到该模型DIO小鼠骨髓瘤发病率高于ND小鼠，且ACSS2抑制剂治疗可显著降低骨髓瘤发病率。上述结果证明ACSS2对于DIO小鼠模型骨髓瘤的生长至关重要。（Figure2）

Figure2

前文仅论述了ACSS2在骨髓瘤生长中的重要性，那么ACSS2具体是通过何种机制影响骨髓瘤生长的呢？首先，作者考虑到脂肪细胞数量作为肥胖与正常体型之间最常见的差异，很有可能参与该过程。因此先用慢病毒转染shACSS2到骨髓瘤细胞中并用荧光素酶标记，小鼠右侧皮下注射骨髓瘤细胞和成熟脂肪细胞的混合物，在对侧仅注射骨髓瘤细胞。观察到植入脂肪细胞的一侧，其生物发光活性和肿瘤重量高于单独植入骨髓瘤细胞的一侧。一致的，运用CRISPR-Cas9技术敲除了骨髓瘤细胞中的ACSS2后，同样可以观察到脂肪细胞一侧发光明显增强。再通过免疫组化染色显示，敲除ACSS2的骨髓瘤细胞中Ki67表达降低，说明细胞的增殖能力被显著抑制。总的来说，这些数据表明ACSS2介导体内脂肪细胞促进的骨髓瘤生长。（Figure3）

Figure3

为了研究脂肪细胞影响骨髓瘤生长的具体机制，作者将成熟脂肪细胞置于10%FBSDMEM培养基中培养三天，再取上清液做条件培养基。用条件培养基培养的骨髓瘤细胞做克隆形成实验，结果与体内研究一致，脂肪细胞的培养基可以增强骨髓瘤细胞的增殖能力。紧接着，作者不仅取脂肪细胞的条件培养基，还用了成骨细胞（OBs）和骨髓间充质细胞（MSCs）的条件培养基对骨髓瘤细胞进行培养，而只有脂肪细胞的条件培养基可以增加骨髓瘤细胞ACSS2的表达，而另外两种间质细胞的条件培养基则无明显效果。至此可以初步判断，是脂肪细胞分泌的某种物质介导了肥胖诱导的ACSS2上调。接下来，作者用蛋白酶K处理了条件培养基培养的骨髓瘤细胞，蛋白酶K是一种非特异性蛋白内切酶，在蛋白酶K处理后条件培养基对ACSS2的促进消失，说明该效应是由蛋白质介导的。进一步，将条件培养基的蛋白质组分分为大于10kDa和小于10kDa的组分，发现骨髓瘤细胞在分子量大于10kDa的组分中对ACSS2几乎没有影响，证明起作用的可能是条件培养基中分子量较小的蛋白质。通过查阅文献，作者筛选了6种已知的脂肪细胞分泌的分子量在10kDa左右或小于10kDa的细胞因子，并将它们分别加入骨髓瘤细胞的培养基中。仅在添加血管紧张素II后，骨髓瘤细胞剂量依赖性增加了ACSS2的表达，而且同时增强了其增殖能力。qPCR显示在所有受试骨髓瘤细胞中都有血管紧张素受体1和2的表达（ATGR1/2），但仅在使用AGTR1抑制剂时才可以消除AngII对ACSS2表达的影响，因此作者将AGTR1作为下一个研究目标。（Figure4）

作者借以上研究，认为血管紧张素II是与AGTR1结合，再传导信号使ACSS2表达升高的。通过查阅文献了解到通过AGTR1激活的通路有PI3K/Akt通路、ERK1/2通路和Jak/Stat3通路。通过WB实验表明在血管紧张素II和AGTR1抑制剂处理后，仅pJAK2没有明显变化，因此JAK2通路可能并不参与该进程。再用PI3K通路抑制剂（LY）和ERK1/2通路抑制剂（U）处理，发现LY可显著抑制血管紧张素II诱导的AKT磷酸化和ACSS2表达，而U治疗无影响，从而确定了PI3K通路是介导血管紧张素II增强ACSS2表达的中间通路。SREBP1是细胞内调控脂类代谢的关键转录因子，且为AGTR1下游的转录因子，主要调控胆固醇和脂肪酸合成中关键酶的表达,一般在正常细胞和组织低表达，在肿瘤组织中高表达，需要经过切割形成成熟亚型mSREBP1才可以发挥转录因子的作用。血管紧张素II的加入显著增加了骨髓瘤细胞中的mSREBP1水平，用PI3K通路抑制剂（LY）或SREBP1抑制剂（氢溴酸盐）可以消除这种效应。同样，CHIP实验证明在ACSS2基因的启动子区域存在着SREBP1的富集，更有力证明了这一观点。（Figure4）

Figure4

为了确定ACSS2的下游靶点，作者通过质谱分析和IP等技术确定了一个与ACSS2最显著相互作用的蛋白——IRF4（干扰素调节因子4）。qPCR分析显示，添加条件培养基、敲除或抑制骨髓瘤细胞ACSS2的水平均不会影响IRF4的mRNA水平，但是与对照组相比敲除或抑制ACSS2却能降低IRF4的蛋白水平。有趣的是，在做相同处理后，IRF4靶基因的mRNA水平也有所降低，同时靶基因启动子区域IRF4的富集也减少了。这些结果说明ACSS2很有可能是在转录后水平调节IRF4的。为了证明该结论，作者用CHX处理骨髓瘤细胞，发现ACSS2抑制剂处理的细胞中IRF4减少的速度比对照组快得多。那么ACSS2是不是通过阻止IRF4蛋白的降解促进IRF4稳定性的?

由于蛋白酶体和溶酶体是负责细胞内蛋白质稳态的两个主要的细胞器，而仅在加入溶酶体蛋白酶抑制剂Leu后才能恢复因为抑制ACSS2导致IRF4的蛋白质水平降低，因此ACSS2是通过溶酶体途径阻止IRF4的降解的。P62和Hsc70是负责自噬介导蛋白质降解的两个关键分子，免疫共沉淀显示p62与IRF4蛋白结合，Hsc70不结合，且抑制ACSS2后，与IRF4结合的p62明显增高。同时，用ACSS2抑制剂处理可诱导IRF4蛋白降解，而p62的敲除则可抵抗ACSS2抑制剂对IRF4降解的影响。WB和免疫荧光显示，抑制ACSS2可增加骨髓瘤细胞中的LC3B-II的水平，减少IRF4蛋白与p62或LC3B的共定位。由于p62一般与泛素化蛋白结合，再被LC3识别后进入自噬体进行降解，所以作者检测了IRF4蛋白的泛素化水平，与对照组相比，芭菲毒素A1处理诱导ACSS2敲除细胞中的IRF4泛素化和p62、LC3B-II的蛋白水平均升高。以上结论证明了ACSS2阻碍IRF4与P62的结合，从而减少p62介导的IRF4蛋白降解。（Figur5）

Figur5

既然明确了ACSS2通过抑制IRF4蛋白降解提高其水平，那么ACSS2是怎么阻碍其与P62结合的呢?ACSS2是乙酰辅酶A合成酶，它通常参与蛋白质赖氨酸乙酰化的调节，自然而然的，作者猜想ACSS2可能是通过影响IRF4的乙酰化来提高其稳定性的。为验证其猜想，作者在抑制ACSS2后，通过IP提取IRF4免疫沉淀物，检测到其中乙酰化赖氨酸水平的减低。为了确定ACSS2诱导的IRF4乙酰化位点，通过质谱分析出了三个可能的位点——59位、87位和位赖氨酸位点。进一步筛选，作者将这三个位点的赖氨酸突变为谷氨酰胺来模拟该位点的乙酰化，而只有位赖氨酸突变时，可以抵抗ACSS2诱导的IRF4降解。且K在不同物种间高度保守，说明该序列可能是生命活动所必需的。为了检测K处IRF4的乙酰化是否影响它与p62的结合，将KQ和KR转入细胞中（KQ是模拟乙酰化，KR是模拟去乙酰化），免疫共沉淀分析显示，与野生型和KR相比，KQ的p62与IRF4结合减少。（Figure6）

至此，研究已得知ACSS2通过促进IRF4的乙酰化从而减少其与p62的结合，而提高IRF4蛋白稳定性，作者接下来试图确定ACSS2激活IRF4蛋白乙酰化的因子。查阅文献可知，赖氨酸乙酰基转移酶（CBP）与ACSS2在细胞中结合。使用免疫共沉淀分析，在骨髓瘤细胞中观察到CBP/ACSS2/IRF4复合物，而且在敲除ACSS2后，与IRF4结合的CBP和ACSS2都有所减少，显然，ACSS2在该复合物的形成中起关键作用。进一步，用CBP抑制剂C处理可显著下调IRF4的乙酰化，而且CBP催化结构域的片段（CBP-CD）孵育后可以刺激IRF4的乙酰化。作者制作了针对IRF4K乙酰化的抗体。运用这种抗体，可看出用ACSS2抑制剂和C治疗的骨髓瘤细胞中IRF4Kac降低。这些结果表明，ACSS2通过激活赖氨酸乙酰化维持IRF4的稳定性。（Figure6）

Figure6

最后，作者为证明IRF4的临床相关性，分别取DIO小鼠和ND小鼠的骨髓样本检测，发现ACSS2、IRF4靶基因表达量和IRF4蛋白水平在DIO小鼠中均升高。再检测了IRF4与BMI指数、ACSS2的相关性，IRF4的mRNA与两者均无显著相关，但蛋白水平却呈明显的正相关，这也与前述结果一致。（Figure7）

Figure7

综上所述，本文揭示了肥胖和骨髓瘤发生的分子机制。在患有骨髓瘤的肥胖患者中，作者发现恶性浆细胞中ACSS2表达升高是由脂肪细胞分泌的细胞因子血管紧张素II诱导的。增加的ACSS2表达通过促进IRF4K的乙酰化，抑制p62与IRF4的结合，从而稳定IRF4蛋白，导致IRF4蛋白水平升高。ACSS2的抑制进一步证实了ACSS2对IRF4的调节在骨髓瘤发生发展中的重要性；ACSS2的抑制降低了IRF4的功能，阻碍了骨髓瘤的生长。因此，作者的研究深刻地探讨了ACSS2在肥胖环境中的肿瘤发生中的详细机制，这对于今后肥胖相关的肿瘤研究有重要的参考意义。

参考文献

[1]LICHTMANMA.Obesityandtheriskforahematologicalmalignancy:leukemia,lymphoma,ormyeloma[J].Oncologist,,15(10):-.

[2]CHANGS-H,LUOS,THOMASTS,etal.ObesityandtheTransformationofMonoclonalGammopathyofUndeterminedSignificancetoMultipleMyeloma:APopulation-BasedCohortStudy[J].JournaloftheNationalCancerInstitute,,(5):

[3]PIETROCOLAF,GALLUZZIL,BRAVO-SANPEDROJM,etal.AcetylcoenzymeA:acentralmetaboliteandsecondmessenger[J].Cellmetabolism,,21(6):-21.

[4]COMERFORDSA,HUANGZ,DUX,etal.Acetatedependenceoftumors[J].Cell,,(7):1-.

[5]SIEGELRL,MILLERKD,JEMALA.Cancerstatistics,[J].CACancerJClin,,69(1):

Notice

原文链接：