MolecularCell来自肝过氧化

年六月美国密苏里州圣路易斯华盛顿大学医学院医学部内分泌、代谢和脂质研究室IrfanJ.Lodhi教授于MolecularCell上发表文章Acetyl-CoADerivedfromHepaticPeroxisomalb-OxidationInhibitsAutophagyandPromotesSteatosisviamTORC1Activation，描述一种过氧化物酶体-溶酶体串扰，它限制脂滴在禁食状态下的自噬降解。结果表明，来自过氧化物酶体β-氧化的乙酰辅酶a通过促进猛禽乙酰化和mTORC1活化而抑制脂肪吞噬。

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是全球最常见的肝病，全球患病率约为25%。NAFLD以肝脂肪变性为特征，可在一部分患者中发展为非酒精性脂肪性肝炎伴炎症和纤维化或肝细胞癌。NAFLD通常与肥胖有关，可通过减肥来逆转。然而，目前还没有专门治疗NAFLD的药物。脂肪肝的发生与脂质稳态失调有关，它是由参与脂质从头合成、摄取、储存和分解代谢的各种代谢途径的协调调节所控制的。因此，靶向脂代谢途径可能是治疗脂肪肝的有效策略。过氧化物酶体在脂质代谢中起重要作用，但仍然是一个被忽视的细胞器。这些多功能细胞器涉及脂质代谢的各个方面，包括乙醚脂质合成、胆汁酸合成、支链脂肪酸的a-氧化和极长链脂肪酸的β-氧化。过氧化物酶体β氧化的第一步由酰基辅酶A完成（CoA）氧化酶1（Acox1），催化酰基辅酶A去饱和为2-反式烯醇基辅酶A。Acox1优先分解直链脂肪酸，而相关酶Acox2和Acox3被认为使用支链脂肪酸和参与胆汁酸合成的中间产物作为底物。Acox1基因敲除小鼠是可行的，但生长迟缓。值得注意的是，随着年龄的增长，这些小鼠在内质网（ER）应激增加的背景下出现脂肪性肝炎并发展成肝癌。与这些结果一致，点突变影响Acox1内含子11–C12的剪接供体位点的小鼠（称为Acox1Lampe1小鼠），导致蛋白的C端结构域部分缺失，也表现出肝脂肪变性，进而发展为脂肪性肝炎，最终发展为肝细胞癌。将Acox1Lampe1小鼠骨髓移植到野生型受体中，再现了肝细胞损伤和系统损伤，表明免疫细胞而非肝细胞本身的Acox1抑制有助于表型的形成。因此，Acox1在肝细胞中的生理意义尚不清楚。

为了研究肝脏过氧化物酶体β-氧化的作用，作者用Acox1基因敲除小鼠肝脏特异性（Acox1LKO小鼠）。在此，作者报告肝脏Acox1缺乏意外地保护脂肪肝免受饥饿或高脂肪喂养引起的脂肪肝，因为脂肪吞噬是降解细胞内脂滴的宏自噬的一个亚型。自噬是一种自我消化的稳态过程，包括溶酶体降解细胞质内容物，包括整个细胞器、蛋白质聚集体和脂滴，通过在货物周围形成一个双膜自噬体，然后与溶酶体融合。自噬受mTORC1（雷帕霉素复合物1的机制靶点）调控，mTORC1是一种关键的生长和代谢调控复合物，包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶mTOR和Raptor，一种调节mTORC1底物招募及其亚细胞定位和激活的衔接蛋白。这个复合体通过感知营养物质来调节自噬。在营养充足的情况下，mTORC1被激活，并通过多个自噬相关蛋白的磷酸化来抑制自噬，包括ULK1（Unc-51样自噬激活激酶1），其促进自噬起始和自噬体的生物发生。mTORC1的激活还导致抑制与溶酶体生物发生和功能相关的基因，包括介导噬脂作用的溶酶体酸性脂肪酶（LAL）。在这里，作者报道了来自过氧化物酶体β-氧化的乙酰辅酶A通过促进mTORC1的活化而抑制脂肪吞噬。这些发现提示抑制肝脏Acox1可能是治疗NAFLD的一个有吸引力的策略。

图1：Acox1（Acox1-LKO）肝特异性基因敲除小鼠的建立

Acox1-LKO小鼠模型基因表达分析表明，Acox1在肝脏中高度表达（图1A）。然而，它在肝脏中的生理作用尚不清楚。已经产生了Acox1基因敲除的小鼠，但它们表现出生长迟缓，这与代谢分析相混淆。因此，作者通过将Acox1-fioxed小鼠与白蛋白Cre小鼠（图1B）杂交产生Acox1-LKO小鼠。定量实时PCR分析显示Acox1LKO小鼠的Acox1表达显著降低，对Acox2或Acox3的表达无影响（图1C）。Westeblot分析证实Acox1基因敲除（图1D）。通过对对照组和Acox1基因敲除的肝细胞进行质谱分析，测量稳定同位素标记的二十二碳烯酸（D3-C22:0）到D3-C16:0的分解代谢，证实了Acox1基因缺陷导致的VLCFA氧化破坏（图1E）。与脂肪酸氧化受损一致，VLCFA在Acox1LKO小鼠的肝脏和血清中累积（图1F）。Acox1LKO小鼠以预期的孟德尔频率出生，明显正常。没有区别2个月或12个月大时对照组和淘汰组动物之间的体重。然而，Acox1LKO小鼠在2个月龄时肝重与体重的比值略有增加，在12个月龄时没有逐渐恶化。Acox1-LKO小鼠的肝糖原含量显著增加，这可能解释了突变小鼠肝重量增加的原因。与Acox1Lampe1小鼠不同，Acox1Lampe1小鼠在8周龄时会发生肝癌，癌标志物的表达显著增加，12个月龄Acox1LKO小鼠的肝脏大体外观正常，并且缺乏癌标志物AFP、H19和Ki67的表达。在Acox1-LKO小鼠的肝脏中也几乎检测不到IL-6和TNF-a，与对照小鼠相似。与肝功能正常的敲除小鼠一致，血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天门冬氨酸转氨酶（AST）水平没有变化。综上所述，这些结果表明肝脏特异性Acox1失活不会导致肝损伤或肝细胞癌。

Acox1脂肪酸对饥饿引起的脂肪肝有保护作用

图2：Acox1LKO小鼠免于饥饿引起的脂肪肝

过氧化物酶体可能在线粒体无法补偿的β-氧化中起作用。鉴于肉碱棕榈酰转移酶2（Cpt2）的LKO对线粒体脂肪酸氧化的抑制加剧了饥饿诱导的脂肪肝，作者试图确定饥饿对Acox1LKO和对照小鼠肝脏的影响（图2）。24小时禁食导致对照组小鼠脂肪肝。然而，Acox1LKO小鼠受到了令人惊讶的保护，免受饥饿引起的脂肪肝（图2A）。Bodipy染色和肝甘油三酯测定证实Acox1-LKO小鼠体内脂质积聚减少（图2B和2C）。这些由雌性小鼠产生的结果在雄性动物中得到证实。为了确定Acox1的丢失是否特异性地介导了脂肪肝保护作用，作者用表达Acox1或GFP的腺相关病毒（AAV）治疗小鼠。AAV-Acox1增加了敲除小鼠的Acox1蛋白水平，并逆转了对脂肪肝的保护作用，导致甘油三酯的积累增加。Acox1-LKO小鼠肝脏脂质堆积减少，有可能重新补充脂肪组织的脂肪分解减少或增加甘油三酯作为极低密度脂蛋白（VLDL）通过肝脏的输出。禁食对照组和Acox1LKO小鼠的血清中游离脂肪酸水平具有可比性（图2D），表明脂肪组织脂肪分解不受Acox1肝脏特异性失活的影响。与这种可能性一致，禁食小鼠的体重或脂肪质量没有基因型特异性差异。Acox1-LKO和对照组之间，用抑制脂蛋白脂酶活性的非离子洗涤剂泊洛沙姆-处理的禁食小鼠的甘油三酯分泌率没有变化（图2E），表明抑制过氧化物酶体β-氧化不会增加肝甘油三酯的输出。血清胆固醇水平在对照组和Acox1-LKO小鼠之间也相似。为了探讨Acox1LKO小鼠抗饥饿诱导脂肪肝的机制，作者接下来进行了基因表达分析（图2F）。参与从头脂肪生成（ChREBP、SREBP、FASN、ACLY和ACC1）和甘油三酯合成途径（AGPAT和DGAT）的基因在肝脏的表达没有变化（图2F）。尽管参与线粒体脂肪酸氧化的基因（Cpt1a和Cpt2）及其上游转录调节因子（PPARa）的表达没有改变，但使用14C标记的线粒体基质棕榈酸酯直接测量脂肪酸氧化，表明过氧化物酶体β-氧化的破坏并不损害而是增加线粒体β-氧化（图2G）。由于过氧化物酶体β-氧化被认为有助于丙二酰辅酶a的产生，一种有效的Cpt1抑制剂，作者测量了Acox1LKO和对照小鼠肝脏中的丙二酰辅酶a水平。尽管无统计学意义，敲除小鼠的水平略低。然而，线粒体β-氧化增加不太可能单独解释Acox1-LKO小鼠对脂肪肝的保护作用，正如先前的研究表明，通过肝脏过表达对丙二酰辅酶A不敏感的Cpt1增加肝线粒体脂肪酸氧化能力不足以预防肝脂肪变性。这可能是因为脂肪酸必须首先通过脂肪分解从甘油三酯中释放出来，然后在线粒体中b-氧化。对照组和Acox1LKO小鼠之间脂解酶（ATGL和HSL）的基因表达没有变化（图2F）。然而，由于控制脂解主要是通过调节脂酶向脂滴的募集而不是在基因表达水平上发生，作者还评估了ATGL脂滴定位是否发生改变。禁食小鼠肝脏的免疫荧光分析表明，Acox1失活并不影响ATGL向脂滴的募集。如上所述，脂肪吞噬是一个替代过程，通过水解储存在脂滴中的甘油三酯，生成游离脂肪酸和甘油。有趣的是，在Acox1-LKO小鼠中，LAL的肝脏表达温和但显著地增加了脂滴的自噬降解（图2F）。

图3：Acox1LKO小鼠表现出肝脏自噬和脂肪吞噬的激活肝脏Acox1基因敲除促进自噬的激活作者接下来确定Acox1基因敲除是否导致肝脏自噬的激活（图3）。Acox1基因敲除肝脏中自噬标记p62和LC3的蛋白质水平显著降低，尽管相应的mRNA水平没有差异（图3A和3B），表明自噬的诱导。与p62和LC3蛋白水平降低再摄取增加自噬fiux的概念一致，用溶酶体蛋白酶抑制剂亮肽治疗小鼠，导致对照组和Acox1-LKO小鼠的自噬标记物积聚（图3C）。为了进一步评估自噬激活，作者使用流体动力尾静脉（HTV）注射来传递表达mCherry-GFP双串联标记LC3的质粒（Ma等人，）来控制和Acox1-LKO小鼠，然后使用或不使用氯喹的治疗，其通过增加溶酶体pH值和阻止自噬体与溶酶体融合来抑制自噬fiux（Mauta等人，）。自噬体表现出mCherry和GFP双重荧光，而自溶体主要表现为红色荧光，因为GFP荧光在酸性溶酶体环境中被猝灭。因此，GFP荧光强度相对于mCherry荧光强度的降低表明自噬荧光强度增加，有趣的是，Acox1LKO小鼠肝脏中的GFP荧光强度降低（图3D和3E），这与这些小鼠的自噬激活一致。正如预期的那样，氯喹治疗阻断了Acox1-LKO和对照小鼠的自噬。考虑到Acox1LKO小鼠对脂肪肝的保护作用，作者下一步确定突变肝脏中的脂滴是否与溶酶体相关，这将提示脂肪吞噬的激活。免疫荧光分析表明，用抗紫苏色素2（PLIN2）抗体染色的脂滴与用抗LAMP2抗体染色的溶酶体共染色（图3F和3G）。这些结果表明，过氧化物酶体β-氧化失活通过脂肪吞噬促进脂滴水解，进而促进线粒体脂肪酸氧化，从而保护脂肪肝。

为了确定Acox1-LKO小鼠的表型是否是由自噬激活介导的，作者在Acox1-LKO或野生型上产生了肝特异性Atg5基因敲除的小鼠背景。正如预期的那样，Atg5基因敲除导致p62和LC3的显著积累，并消除了Acox1-LKO小鼠中这些自噬标记物的减少，证实这种减少是由自噬诱导介导的。令人惊讶的是，Atg5的单基因敲除也显著降低了Acox1的水平，可能重新激活了一种反馈机制。单独或在Acox1失活的情况下，Atg5基因敲除导致巨大的肝脏肿大，这与先前的报告一致，即自噬基因失活导致严重的肝损伤，其特征是多种病理学，包括纤维化、肝损伤，血清和AST水平增加，蛋白质显著积累，以及肿瘤发生。Atg5LKO小鼠的肝甘油三酯含量反常地降低，这与最近的研究一致，即除了调节脂滴的降解外，脂滴的生物生成可能还需要自噬。联合肝脏特异性Atg5和Acox1基因敲除不会进一步降低甘油三酯含量。总的来说，虽然抑制肝脏中的大自噬会导致严重的异常和复杂的表型，这是由于该过程的多效性，但多方面的证据支持作者的观点，即通过药理学或遗传激活脂肪吞噬，意味着防止肝脏脂肪变性。

图4:肝Acox1失活降低乙酰辅酶A水平，导致mTORC1活化受损过氧化物酶体β-氧化是乙酰辅酶a调节mTORC1自噬轴的主要来源，作者接下来试图了解肝脏过氧化物酶体β-氧化的破坏如何促进脂质的自噬降解（图4）。在饥饿条件下，通过激活AMPK诱导自噬，AMPK反过来磷酸化并激活ULK1。因此，作者确定Acox1失活是否影响肝脏AMPK的激活。Westeblot分析表明，Acox1-LKO小鼠AMPK的Thr磷酸化（AMPK的活化所需）没有改变。因此，作者探索了其他可能的机制。过氧化物酶体β-氧化的产物之一是过氧化氢（图4A），据报道，过氧化氢是一种活性氧物种（ROS），通过激活过氧化物酶体的结节硬化复合物（TSC）信号节点诱导自噬，并随后抑制mTORC1。为了了解Acox1基因敲除对肝脏ROS的影响，作者生成了一种过氧化物酶体靶向形式的RoGFP（RoGFP-SKL），这是一种氧化还原敏感的GFP，除了GFP的规则激发波长（约nm）外，在nm处出现第二个激发峰（氧化状态的再吸收）。作者用HTV注射法，在肝组织中表达了RoGFP-SKLAcox1LKO和对照小鼠，并通过共焦显微镜检测荧光。两种不同波长激发后荧光强度比的量化表明，Acox1基因敲除肝脏中过氧化物酶体活性氧水平显著降低。线粒体也是活性氧的主要贡献者。然而，Acox1基因敲除肝脏中的线粒体靶向RoGFP（mitoRoGFP）也降低了活性氧水平，这可能是过氧化物酶体活性氧产生减少的第二个影响，因为过氧化氢可以在细胞器膜上自由扩散。由于Acox1失活降低了过氧化氢的产生，Acox1-LKO小鼠的自噬诱导可能不是由活性氧水平升高引起的。过氧化物酶体β-氧化的另一产物是乙酰辅酶A（图4A）。β-氧化的每一个循环产生一个短于两个碳的酰基链，末端乙酰辅酶A基团发生硫裂解。细胞溶质乙酰辅酶a被认为是自噬的关键代谢调节因子，其消耗足以诱导一般自噬。最近的研究表明，来自亮氨酸分解代谢的乙酰辅酶A促进Raptor的乙酰化，导致溶酶体定位和mTORC1的激活。然而，是否Raptor乙酰化介导的这个或任何其他乙酰辅酶A池调节自噬尚未确定。因此，作者询问过氧化物酶体衍生的乙酰辅酶a是否通过激活mTORC1调节肝脏脂质的自噬。首先，作者测定了抑制过氧化物酶体β-氧化对肝脏乙酰辅酶a水平的影响。值得注意的是，禁食Acox1LKO小鼠的总细胞溶质乙酰辅酶A池低于对照小鼠水平的50%（图4B）。这是令人惊讶的，因为细胞溶质乙酰辅酶A被认为主要来自柠檬酸盐，通过ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）的作用。酰基辅酶A合成酶短家族成员2（ACSS2）将乙酸转化为乙酰辅酶A，也参与了胞浆池的形成。然而，随着禁食时间的延长，ACLY和ACSS2的肝脏基因表达均明显下降，Acox1基因表达增加。此外，根据定量实时PCR的周期阈值（Ct）值，Acox1在肝脏中的表达可能比ACLY和ACSS2都高（图4C）。Westeblot分析证实，在禁食的肝脏中Acox1表达增加，ACLY和ACSS2表达减少（图4D）。因此，Acox1介导的脂肪酸氧化是肝细胞内乙酰辅酶a的主要来源，特别是在禁食状态下。

接下来，作者确定Acox1失活是否影响Raptor乙酰化。为此，作者用HTV注射法在Acox1-LKO和对照小鼠的肝脏中表达了一个FLAGRaptor质粒。使用抗FLAG抗体进行免疫沉淀，然后使用抗乙酰化赖氨酸（AcK）抗体进行westeblot分析，表明突变小鼠中Raptor乙酰化明显减少（图4E）。确定Acox1失活是否影响内源性Raptor和其他蛋白质，作者让来自FastedMice的肝脏裂解物使用AcK抗体进行免疫沉淀。Westeblot分析表明Raptor乙酰化显著降低，而组蛋白H3的乙酰化不受Acox1基因敲除的影响（图4F和4G），表明过氧化物酶体衍生的乙酰辅酶a可能在乙酰化中具有选择性作用。在这方面，先前的研究表明溶酶体与过氧化物酶体形成膜接触。值得注意的是，利用抗过氧化物酶体和溶酶体标记抗体的免疫荧光分析表明，禁食促进过氧化物酶体与肝脏溶酶体的共定位（图4H和4I），增加了溶酶体相关Raptor可能通过局部生成的过氧化物酶体乙酰辅酶A介导的乙酰化。与受损的Raptor乙酰化相一致，mTOR的溶酶体定位在Acox1基因敲除的肝脏中被阻断（图4J和4K）。鉴于活化需要向溶酶体分配mTOR，如通过下调mTOR的Ser磷酸化和下调其下游靶点的磷酸化来评估，Acox1失活导致mTOR抑制（图4L）。重要的是，mTORC1抑制导致调节自噬的ULK1的Ser磷酸化降低。有趣的是，Acox1-LKO小鼠的PLIN2水平也降低了（图4L）。与脂质滴自噬降解增加的可能性一致，禁食对照组和Acox1-LKO小鼠经腹腔注射亮氨酸肽导致PLIN2积聚（图4M）。由于mTORC1受能量状态的调节，作者还确定其激活是否受喂食和禁食条件下Acox1基因敲除的影响（图4N）。禁食显著抑制了控制mTORC1途径合成代谢臂的S6K磷酸化，Acox1基因敲除的肝脏中残余磷酸化进一步降低。在相反，调节分解代谢臂的ULK1磷酸化仅被禁食部分抑制，而Acox1基因敲除则完全抑制ULK1磷酸化。这些数据表明，即使在禁食条件下，Acox1仍维持mTORC1激活和抑制ULK1磷酸化的基础水平。

图5：增加乙酰辅酶A水平可恢复Acox1LKO小鼠的mTORC1激活、抑制自噬和升高甘油三酯水平增加乙酰辅酶A水平可恢复Acox1-LKO小鼠的mTORC1激活，抑制自噬，并升高甘油三酯水平，以确定Acox1-LKO小鼠mTORC1激活受损和肝甘油三酯积累减少是否是由于胞浆乙酰辅酶A水平降低所致（图5），作者用二氯乙酸（DCA）治疗Acox1LKO小鼠（图5A），其通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）从而提高细胞乙酰辅酶A水平，从而促进丙酮酸脱氢酶（PDH）的激活。正如预期的那样，DCA治疗挽救了Acox1LKO小鼠的肝脏乙酰辅酶A水平（图5B）。值得注意的是，这种干预使Acox1-LKO小鼠肝脏中的Raptor乙酰化水平恢复到与对照小鼠相似的水平（图5C和5D）。因此，DCA治疗AcoxLKO小鼠后，mTOR的溶酶体定位增加到与对照小鼠相当的水平（图5E和5F）。这导致mTOR活化和ULK1磷酸化增加，导致自噬抑制，通过Acox1-LKO肝脏中p62和LC3的积聚而重新得到补充（图5G）。与抑制脂肪吞噬相一致，DCA治疗降低了Acox1LKO小鼠肝脏中PLIN2与LAMP2的共定位（图5H和5I），并部分恢复了突变小鼠的肝脏甘油三酯水平（图5J），而不影响甘油三酯合成途径相关基因的表达（图S5）。总之，这些结果表明来自过氧化物酶体β-氧化的乙酰辅酶a通过介导mTORC1的激活抑制脂质的自噬降解。

图6：Acox1-LKO小鼠对HFD诱导的脂肪肝有保护作用Acox1LKO小鼠受到高脂肪饮食诱导脂肪肝的保护，作者接下来调查了作者发现的临床相关性（图6）。肥胖与NAFLD风险增加相关。有趣的是，与瘦人相比，肥胖人肝脏中Acox1基因的表达有更高的趋势（图6A）。在小鼠中，高脂肪喂养导致肝细胞1基因表达不明显增加（图6B）。因为Acox1脂肪酸对饥饿引起的脂肪肝有保护作用，作者确定这些小鼠是否也对高脂饮食（HFD）引起的脂肪肝有保护作用。有趣的是，Acox1LKO肝脏与对照组相比明显苍白，这表明对饮食引起的脂肪变性有保护作用（图6C）。肝切片的组织学分析显示Acox1-LKO小鼠的脂滴明显较小（图6D）。与这些结果一致，Acox1LKO小鼠的肝甘油三酯含量低于对照小鼠（图6E）。作者还评估了Acox1失活对高脂喂养下mTORC1激活的影响。与对照小鼠相比，Acox1-LKO表现出肝mTORC1激活受损，通过mTOR、S6K和ULK1磷酸化降低进行评估（图6F）。总之，这些数据表明Acox1LKO小鼠通过激活由抑制mTORC1引起的自噬/脂肪吞噬而免受HFD诱导的脂肪肝的影响。

总之，这些研究确定了一个以前未被认识的过氧化物酶体溶酶体代谢环节，它限制了脂滴的自噬降解。我们的结果表明过氧化物酶体β-氧化是维持肝脏脂质稳态的胞浆乙酰辅酶a的主要来源。脂质诱导通过抑制过氧化物酶体乙酰辅酶a的产生来实现自噬可能为NAFLD的治疗提供一种新的选择。

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