12号作品重要抗癌植物篦子三尖杉叶绿体

裸子植物最早出现于3亿万年前至3亿万年前的古生代泥盆纪，历经古生代、中生代和新生代等多个世代。在裸子植物漫长的演化过程中，由于出现了多次重大的地质和气候变化，裸子植物各谱系也随之发生过多次演变和更替。裸子植物现存多种，占所有陆生植物物种的0.29%，多数发生于约万年前至万年前之间的新生代第三纪，并经历第四纪冰川保留至今。因此不少裸子植物为濒危孑遗植物，且多为林业、药学的重要用材物种，具有独特的经济价值和生物学价值。

篦子三尖杉（CephalotaxusoliveriMasters）隶属三尖杉科三尖杉属，为国家二级珍稀濒危植物，是古老孑遗物种。属灌木，高可达4米，树皮多为灰褐色，叶条形，质硬，平展成两列，排列紧密，常中部以上部分向上微弯（图1）。

图1篦子三尖杉叶和果实形态。

篦子三尖杉具有非常重要的药用价值，枝叶、树皮都可以提炼生物碱可以作为抗癌药物。在三尖杉的生物碱中，最重要的为三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱，两者均可作为抗癌药物的原料。但是，三尖杉植株小、罕见有成片生长成优势群落，自然分布零星，数量和资源极为稀少。借助传统方式，通过砍伐植株来提炼生物碱的模式显然不可取。药用植物基因工程的研究和应用已经在提高药用植物生产效率和品质、减轻资源的压力等方面有了很好的范例，因此植物基因工程是发挥篦子三尖杉药用价值最快捷、最有前途的手段之一，通过对其药用成分筛选、优化和改良，进而期望实现篦子三尖杉药用价值的后期商业化应用。另一方面，与基于细胞核转化的传统基因工程相比，叶绿体基因工程具有表达高效、免疫基因沉默、安全系数高、允许多基因同时转化等优点。叶绿体基因组的全序列信息提供全面的生物反应整合位点，并且基于叶绿体基因组的全序列，可以直接得到内源调控信息，从而方便快捷地提高外源基因表达量。

通过测定三尖杉、篦子三尖杉两种植物的叶绿体基因组（图2），并且利用已有的其他裸子植物叶绿体基因组，采用生物信息学手段对裸子植物叶绿体基因组的结构变异和进化动态进行了深入分析。

图2篦子三尖杉叶绿体基因组环形图谱（以不同颜色标注不同功能的基因；其长度代表其相对大小；色块的相对位置代表了基因在叶绿体基因组上的相对位置；环内侧的基因顺时针转录，环外侧的基因逆时针转录。）

1）重建松杉类叶绿体基因组的基因排列顺序形成过程。综合考虑叶绿体DNA异构现象的存在（图3），对于松科和非松科植物反向重复区的丢失我们推测出了多种进化路径。（图4）

图3叶绿体基因组“神奇”的异构发生示意图（LSC大单拷贝区，SSC小单拷贝区，IR反向重复区）。通过两个大小一致，序列信息完全相反的反向重复区“桥式重组”形成两个不同的叶绿体基因组异构体。

图4基于基因组重排模拟的裸子植物叶绿体基因组进化途径。裸子植物叶绿体基因组从上下两端的原始序列（苏铁模式的不同异构型），延着箭头方向，通过不同的基因排列中间形态（A-D），演化为图中间的高级形态（雪松模式）

2）分析得到裸子植物叶绿体基因组的高变区域。通过属内叶绿体基因组的精细比较（图5），发现叶绿体基因组通常具备的几大类序列变化：“重复序列、插入/缺失及碱基替换”（这几类变化也是所有DNA序列中的主要变化类型），它们之间存在显著相关性；这暗示重复序列是引发插入/缺失和碱基替换发生的重要因素。这些高变位点为叶绿体基因工程提供了极为关键的靶位信息。

图5三尖杉属内叶绿体基因组精细比较。左边为篦子三尖杉，右边为台湾三尖杉，它们同属但不同族。自上往下是叶绿体基因组图谱线性形式。不同色块代表不同功能的基因；其长度代表其相对大小；色块的相对位置代表了基因在叶绿体基因组上的相对位置；中轴线左侧的基因顺时针转录，右侧基因逆时针转录。

3）在松杉类植物中，有一个关键基因AccD，该基因是负责编码乙酰辅酶A羧化酶（ACCase,EC6.4.1.2）的羧基转移酶（β-carboxyltransferase）β亚基。乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A，是脂肪酸生物合成的限速酶，也是碳流进入脂肪酸生物合成途径的重要调控位点。分析得知该基因之所以发生基因编码区长度的急剧扩张是因一个含有多个重复序列的大片段的插入而引起（图6），这进一步佐证了重复序列对改变三尖杉属叶绿体基因组结构的重要性。

图6裸子植物重要脂肪酸合成调控基因AccD编码区扩增变化图。（选取苏铁、银杏、黑松、日本柳杉、台湾杉和两种三尖杉进行AccD基因对位排列，重复序列见于B部分的彩色色块标记，A和C部分分别为基因编码区的起始端和终止端。）

结论：

1、裸子植物叶绿体基因组的演化存在多种途径，而非前人认为的单一模式；

2、叶绿体基因组中，重复序列可能是引发插入/缺失和碱基替换发生的重要因素。重复序列丰富的热点区域是叶绿体基因工程潜在的靶点；

3、重复序列同样可能是叶绿体基因内部编码区扩张和收缩的重要因素，这为我们对重复序列在基因组中作用的理解提供了新观点。